EDF介导靶向启动higBA毒素-抗毒素系统的锁核酸脱氧核酶对Mtb的凋亡作用研究

课题拟构建一种细胞外死亡因子（EDF）五肽偶联的、特异切割结核杆菌（Mtb） higA抗毒素mRNA的锁核酸（LNA）脱氧核酶（DNAzyme），内外双向启动Mtb固有的细菌程序性细胞死亡（BPCD）机制，对Mtb感染进行治疗。EDF是靶向结合到G+胞壁上并传递凋亡信息的细菌"群感应信号"（QS），其活性基序是一段五肽分子；Mtb天然存在的higBA毒素-抗毒素系统（TA ）由一对共表达基因构成，其中higB编码具有自杀作用的毒素，必须依赖共表达的higA抗毒素对其抑制，Mtb才能正常存活。higA抗毒素本身还是一种转录抑制子，它被特异切割以后，导致TA平衡被打破，菌体内higB毒素将会大量堆积，继而引发不可逆的BPCD过程，产生杀菌作用。锁核酸构建的脱氧核酶具有良好的生物安全性、穿透性、特异性和稳定性，其杀菌机理与目标Mtb是否耐药株无关，本研究对探索耐药菌基因治疗的新思路具有重要意义。

项目背景.结核病是单一病原引起死亡的严重传染病之首，但近40年中无任何抗Mtb新药研发出来。EDF是一种可靶向结合细菌细胞壁并传递凋亡信号的“群感应信号”；Mtb基因中天然存在的毒素-抗毒素系统由一对共表达基因构成，其中higB 编码具自杀作用的毒素，依赖higA抗毒素共表达对其抑制，Mtb才能存活。higA被切割以后，higB将大量堆积，引发不可逆的细菌程序性死亡（BPCD），产生杀菌作用。.主要研究内容.研究旨在探索运用一种完全不同于传统抗生素的杀菌机制，绕过多药耐药难关，利用Mtb自身“自杀机制”，构建一种EDF五肽偶联、特异切割Mtb中higA-mRNA的LNA-DNAzyme，治疗Mtb感染。从多个设计中筛选出具有最佳基因治疗效果的EDF修饰的LNA-DNAzyme，在体外、细胞内、动物模型上对其致Mtb凋亡和治疗作用、机制进行研究。.重要结果与关键数据.完成了EDF偶联的靶向Mtb-higA锁核酸脱氧核酶LDzyme 1~6 的设计、合成与修饰；构建了higA、higB表达载体，获得了higA-mRNA产物；筛选出2条具有高效切割higA-mRNA的锁核酸脱氧核酶；表达纯化了higA重组蛋白；获得了高效价抗higA兔多克隆抗体；胞外层面，发现该核酶对Mtb有显著杀伤作用；胞内层面，发现该核酶能有效切割Mφ内感染Mtb的higA-mRNA，并显著抑制Mtb在Mφ内的存活；并证明其对Mφ本身无毒副作用；动物体内层面，发现该核酶对Mtb感染小鼠肺结核有良好治疗作用；获得了IL-27重组蛋白，为后续和核酶共治疗Mtb感染打下基础；获得并分析了山东省一市区8 000例疑似结核病患者Mtb感染及药敏情况数据，为后续研究Mtb感染区域与个性化治疗打下基础；完成了Mtb-higA、higB生物信息学分析, 为深入研究higA、higB互作机制奠定了基础。.科学意义.EDF修饰的靶向higA-mRNA的LNA-DNAzyme具有良好的生物安全性、穿透性、特异性和稳定性，其杀菌机理与Mtb是否多耐菌株无关，本研究对开发新型Mtb靶向基因治疗药物具有重要意义，也为探索其他耐药菌基因治疗开拓了新思路，具有重要科学探索价值和现实意义。