小麦生理型雄性不育靶标蛋白定位及其组分与功能研究

为揭示以自主知识产权新型杀雄剂SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育分子机理，特别是杀雄剂处理后的特定靶标蛋白或者所饰变靶标基因的探索，本研究在以往对杀雄剂SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育过程中，关于育性基因转录调控关键机制和细胞核、叶绿体以及线粒体育性差异蛋白表达研究的基础上，拟重点攻克：（1）采用Drug-western方法筛选SQ-1作用的靶标分子；（2）针对靶分子的cDNA序列，采用RNAi技术下调靶基因的表达验证该基因功能；（3）应用免疫组织化学的方法检测靶分子蛋白在细胞中的位置；（4）利用酵母双杂交技术筛选与靶分子蛋白互为代谢网络的蛋白质。通过上述研究旨在获得SQ-1作用的靶分子，初步阐明靶分子在小麦生理型雄性不育过程中的作用机理，这在开发新型小麦杀雄剂或者杂交剂以创制多途径利用小麦杂种优势，以及从本质上揭示小麦生理型雄性不育机理，乃至遗传型雄性不育机理具有重要的科学价值和实践意义。

为揭示小麦生理型雄性不育靶标蛋白及其组分与功能,本研究首先从筛选化学杂交剂SQ-1喷施小麦后的靶标分子开始，其后针对靶分子的cDNA序列，验证所筛选蛋白的功能，并应用免疫组织化学的方法检测靶分子蛋白在细胞中的位置，利用酵母双杂交技术筛选与靶分子蛋白互为代谢网络的蛋白质。取得下述重要进展与结果：. （1）首次建立了一种专门用于检测小麦喷施SQ-1化学杂交剂后，其单株体内残留的化学杂交剂主成分，即杀雄嗪酸的高效液相色谱法(HPLC)。. （2）以噬菌体λTriplEx2为载体，利用SMART技术构建起小麦单核期花药cDNA表达文库；以生物素为报告基因，合成苯哒嗪（SQ-1主成分）小分子探针，然后利用该探针在cDNA表达文库中进行苯哒嗪靶标蛋白基因的筛选。成功构建出一种新型有效的药物印迹筛选法，获得了一条能够与苯哒嗪结合的蛋白基因cDNA序列，其编码蛋白属于DUF3456家族。. （3）采用酵母双杂交法，筛选得到与小麦TaPDK（小麦丙酮酸脱氢酶激酶）互作的一个新结合蛋白，该蛋白被命名为增殖细胞核抗原(TaPCNA)。研究表明，在生理型不育系中，TaPCNA与小孢子的细胞周期发育密切相关，很有可能SQ-1化学杂交剂通过一定介导（如：TaPDK）与TaPCNA互作，进而影响到生理型不育小孢子异常发育与分裂，最终导致败育。. （4）利用反转录PCR（RT-PCR）克隆了小麦细胞增殖核抗原（PCNA）基因的cDNA序列，命名为TaPCNA(GenBank登录号:KM087781)。测序结果显示，小麦TaPCNA基因编码区为792bp，编码263个氨基酸，分子量约为29.16kD，理论等电点为4.53。. （5）利用酵母双杂交系统筛选出6个与TaPCNA互作蛋白，这些蛋白主要参与细胞周期调控以及DNA损伤修复。经研究杀雄剂SQ-1喷施小麦后，先诱导受体花药中DNA损伤，然后推迟与阻止细胞分裂，进而影响花粉细胞发育而产生败育。.此外，本项目还研究了生理型小麦雄性不育过程中涉及到的相关多聚泛素化差异蛋白，利用质谱鉴定，得到127和131个差异表达的多聚泛素化蛋白，其与小麦雄性不育直接相关，这些蛋白是否亦是化学杂交杀剂作用后的靶蛋白，还有待深入研究。. 上述研究结果，为揭示小麦生理型雄性不育靶标蛋白及其组分与功能奠定了坚实理论基础与技术支撑。