拟南芥Argonaute10调控不定芽再生的分子机制研究

The study of shoot regeneration mechanism has become a research focus these years. However, the post-transcriptional control of shoot regeneration is not clear now. In our previous studies, the knockout mutant ago10 and activation-tagged mutant men1 exhibited increased shoot regeneration capabilities. We presume that AGO10 controls shoot regeneration by regulating the expression of miR165/6. In this study, the following experiments will be carried out with Col-0, ago10, 35S::AGO10, MIM165/6 and men1: 1) determine which step was influenced by AGO10 and miR165/6 through analyzing the shoot regeneration processes and analyze the genetic relationship of AGO10 and miR165/6 by plant crossing; 2) analyze the expression of key genes of shoot regeneration in ago10 and men1 background; 3) screen the candidate genes regulated by AGO10 and finally illustrate the molecular mechanism of AGO10 in regulating shoot regeneration.

植物不定芽再生机制研究已成热点，但有关转录后调控因子的作用仍不清楚。我们发现RNA沉默复合效应子突变体ago10（敲除系）和miR166a激活标签突变体men1的不定芽再生能力高于野生型，推测AGO10通过调控miR165/6表达影响不定芽再生。在此基础上，本研究拟利用Col-0、ago10、35S::AGO10、MIM165/6（敲除系）及men1进行以下研究：1）分析上述材料不定芽形成过程，确定AGO10和miR165/6对不定芽形成不同阶段的作用大小，并利用植物杂交互补，确定二者的遗传学关系；2）分析不定芽再生相关基因（如干细胞相关、激素途径等）在ago10和men1背景下的表达变化，确定它们的协调作用关系；3）利用miRNA芯片，筛选受AGO10调控的候选miRNA，分析其突变体不定芽再生能力，确定目标miRNA及可能参与的调控网络，最终揭示AGO10调控离体苗再生的分子机制。

与动物细胞相比，植物细胞具有更强的全能性，已经分化的细胞能够重新获得干细胞的分化潜能，并经过分化形成新的组织和器官到再生植株。尽管完善的植物离体再生技术体系已建立了超过一个世纪，但迄今为止，对于植物体细胞在离体条件下如何重建生长点的机制，尤其是转录后调控因子的作用仍不清楚。. 本研究围绕“AGO10调控不定芽再生的作用及机制”科学问题，利用Col-0、ago10（敲除系）、p35S::AGO10（过表达系）、MIM165/6（敲除系）、men1（过表达系）等材料开展研究，取得了以下结果：（1）分析了Col-0、ago10不定芽形成过程，发现AGO10抑制不定芽起始及发育；（2）分析了不定芽再生相关基因WUS、CLV3及STM在ago10和Col-0背景下的时空表达情况，发现AGO10通过抑制离体生长点重建抑制不定芽起始及发育；（3）分析了pAGO10::GUS在不定芽再生过程中的时空表达模式，发现AGO10在不定芽起始部位、正在发育的不定芽顶部分生组织区表达，表明AGO10的时空表达与其功能高度一致；（4）分析了pU2::165/6-GFP（可显示miR165/6的活性部位）及ago10 × pU2::165/6-GFP在不定芽再生过程中的时空表达变化，发现在不定芽起始及发育中AGO10抑制miR165/6的活性，表明miR165/6可能处于AGO10的下游；（5）鉴定了ago10、ago10 × MIM165/6和MIM165/6不定芽再生能力，确定了不定芽起始及发育中AGO10作用于miR165/6的上游；（6）筛选到可能到受AGO10调控的候选miRNAs，发现miR319促进不定芽再生。. 综合以上结果，本研究鉴定得到了一个新的不定芽再生抑制子AGO10，并从干细胞水平上确定了AGO10、miR165/6与WUS在调控离体生长点重建中的协调作用关系，为深入了解表观遗传因子对植物细胞“全能性”调控提供了新的线索。.