雷公藤内酯醇靶蛋白的发现及其作用机理的研究

利用噬菌体表面展示肽库技术筛选与雷公藤内酯醇特异结合的氨基酸序列，通过序列比对确定了一种雷公藤内酯醇可能的靶蛋白；在体外克隆表达该蛋白，分离纯化后在体外分子水平上验证雷公藤内酯醇与该蛋白的相互作用；构建该蛋白的镇和表达质粒及RNA干扰质粒，在细胞水平上验证雷公藤内酯醇与该蛋白的相互作用；初步分析该靶蛋白介导的雷公藤内酯醇的作用机理。同时依靠噬菌体表面展示肽库技术继续筛选雷公藤内酯醇的其它靶蛋白，研究其作用机理，建立雷公藤内酯醇不同生物学效应与不同靶蛋白介导的作用机理之间的对应关系；指导药物分子的修饰和改造，开发高效低毒、特异性针对某一条作用途径起作用的的药物分子。

利用噬菌体表面展示肽库技术以及序列比对方法筛选雷公藤内酯醇可能的靶蛋白，重点对其中得分较高的人类固醇生成因子1（human steroidogenic factor-1，hSF-1）与雷公藤内酯醇的相互作用进行进一步的研究。在大肠杆菌中成功表达并纯化得到了hSF-1的配体结合结构域LBD，在体外分别通过荧光光谱实验、ITC实验和SPR实验验证了hSF-1 LBD与雷公藤内酯醇的特异性结合。构建了hSF-1的真核表达质粒以及干扰RNA，为进一步在细胞水平上研究雷公藤内酯醇与hSF-1的相互作用做好了准备。利用原代T细胞研究了雷公藤内酯醇对T细胞增殖的抑制作用，以及其作用机制，初步证明雷公藤内酯醇可以在转录水平上抑制Lck通路相关蛋白的表达。在小鼠模型中，发现雷公藤内酯醇在体内确实能够抑制T细胞的活化，并且也是通过调节Lck通路实现的。雷公藤内酯醇在延迟性炎症动物模型中能够明显抑制炎症反应，其机制是抑制T细胞活化和增殖。通过生物信息学收索和筛选发现雌激素受体（ER）具有较高的可能性，在此基础上，进一步分析了雷公藤内酯醇与ERa的结合自由能以及结合的关键基团；显示雌激素受体可能是雷公藤内酯醇调控T细胞增殖和活化作用的靶点。.同时利用生物信息学方法继续筛选雷公藤内酯醇的靶蛋白，利用对接软件AUTODOCK 4.0，模拟退火算法，从中科院上海药物所构建的PDTD （Potential Drug Target Database）数据库的4000多个人类潜在靶标蛋白中搜索与雷公藤内酯醇可能作用的蛋白靶标，并对结果进行进一步的分析、归类，发现其中主要包括：核受体类（激素受体）、固醇激素代谢酶类、信号传导相关的蛋白激酶类、炎症相关因子代谢酶类、血管生长相关蛋白类等。.考虑雷公藤内酯醇仍是目前临床上治疗银屑病的主要药物之一，而银屑病的发生涉及表皮角质细胞增生、血管生成以及炎症细胞浸润，我们首先选取包括视黄酸受体、血管生成因子受体、炎症相关因子三类不同靶标蛋白，利用对接软件AUTODOCK 4.0，通过遗传算法进行更为精确的分析，对接结果提示雷公藤内酯醇可能主要通过视黄酸受体通路发挥作用。