RANKL/RANK/OPG系统在经缝牵引成骨中的作用

The molecular mechanism of the trans-sutural distraction osteogenesis and the optimal distraction force have not been clarified. It is speculated that trans-sutural distraction osteogenesis is based on a balance between osteoblasts and osteoclasts. RANK/RANKL/OPG system plays a central role in bone remodeling. In this study, a model is designed to investigate the effects of different dose of distraction forces for separation of the circummasillary sutures on craniofacial growth in growing rats. Radiographs are taken, and specimens are harvested at 1, 2, 3,4,6 week after initiating the distraction protocol. Tartrate-resistant acid phosphatase staing is used to detect activated osteoclasts. Temporospatial expression of osteoprotegerin（OPG）and RANKL are investigated by using immunohistochemistry, in situ hybridization and reverse transcription polymerase chain reaction. Semi-quantitative analysis are used to characterize OPG, RANKL and RANKL/OPG ratio. This study will be directed toward unraveling the molecular mechanisms regulating trans-sutural distraction osteogenesis, searching for optimal distraction force for sutural growth, and exploring a ideal time to use OPG or RANKL antagonist to accelerate trans-sutural distraction osteogenesis.

经缝牵引成骨的分子机制及最佳牵引力至今尚未完全阐明。我们推测经缝牵引成骨应遵循骨形成与骨吸收平行进行的骨重塑过程。RANKL/RANK/OPG系统作为骨重塑过程的关键调节者对破骨细胞形成和活化起着重要作用。而破骨细胞功能和RANK/RANKL/OPG系统在经缝牵引成骨的作用尚未见报道。本研究以生长发育期的大鼠为实验动物，建立经面缝牵引成骨促进上颌骨复合体生长的缝牵引成骨实验模型。在经缝牵引开始后1、2、3、4、6周拍摄X线片、取材，进行颅面骨骼形态学测量分析及TRAP染色、免疫组化、原位杂交、RNA提取和RT-PCR检测，观察不同牵引力作用下缝生长与OPG、RANKL和RANKL/OPG值及破骨细胞在缝区的时空表达。探索经缝牵引成骨的分子机制；寻找促进面缝生长的最佳牵引力；探索局部使用OPG或RANKL拮抗剂的适宜时机，以加快缝生长。

经缝牵引成骨术已被临床证实为矫正面中部骨骼发育不全的有效方法，但其在应用过程中仍有若干问题尚未解决，如患者年龄的选择、技术要素最适值的确定以及牵引术后复发的预防策略等，而这有赖于对经缝牵引成骨的机制进行研究。本研究第一部分以不同年龄段SD雄性大鼠为实验动物，获取颧上颌缝为主要研究对象，采取组织学染色、Micro-CT、RT-PCR及血浆蛋白定量的检测方法，结果发现随年龄增加，缝区成纤维母细胞逐渐减少，相邻骨板逐渐增厚，骨质变得致密。Micro-CT结果示缝区组织密度显著升高，缝区与相邻骨质的密度比值由4周龄的0.14:1升高至13月龄的0.54:1。局部缝区组织RT-PCR及血浆蛋白定量结果显示RANKL、OPG的表达量并未随年龄的增加呈现出显著地量效关系，而ALP、OC的表达量则有明显降低的趋势。上述结果表明随年龄增加缝区受外力牵引成骨的能力逐渐降低，提示对处于生长发育期患儿实施经缝牵引成骨术可能为最适时机。第二部分以4周龄生长发育期SD雄性大鼠为实验动物，在成功建立经缝牵引成骨动物模型后对大鼠大体颅骨及各面缝组织进行Micro-CT扫描，同时与临床实际患儿牵引前后头颅三维CT形态学变化进行对比分析，结果发现牵张组表现为颧上颌骨复合体生长前移伴骨缝扩张及新骨形成，而压缩组表现为颧上颌骨复合体生长受限伴骨缝变窄及骨质沉积。进一步对缝区结构进行扫描，结果发现动物模型和临床病例均显示翼上颌缝区最为显著的受力改变伴上颌结节区新骨形成，提示该结构可能在经缝牵引促进面中部骨骼生长前移过程中发挥关键性作用。第三部分在成功建立经缝牵引成骨动物模型基础上，对颧上颌缝进行HE、番红固绿、免疫组化染色及转录组测序，组织学结果发现牵张组缝区细胞增殖明显，成骨功能活跃，而压缩组缝区细胞数量减少，成骨功能减弱，成骨方式表现为典型的膜内成骨方式。转录组测序预实验结果示Wnt、TGF-β以及BMP信号通路相关基因富集情况有一定的显著差异，提示其可能在缝区细胞受力成骨的早期活动中扮演调控增殖分化的作用。