柑橘单核苷酸多态性分子标记的开发及其在杂种区分和柚品种遗传多态性研究中的应用

采用计算机软件包处理现有柑橘表达序列标签（EST）DNA序列数据，剔除载体、克隆和测序误差、异位同祖基因（paralogous gene）等干扰因素，筛查高质量候选单核苷酸多态性分子标记（SNP）10000个，收录到SNP数据库。根据实验室现有技术要求，设计候选SNP的PCR引物，采用PCR-SSCP(单链构象多态性)、PCR-RFLP（限制性酶切片段多态性）、荧光定量PCR、必要时测序等技术试验验证候选SNP。利用验证了的具有多态性的SNP标记，分析50份柚品种资源的10个SNP位点，研究柚品种资源的遗传多态性，探讨柚品种起源和相互间的亲缘关系，建立重要柚品种基于SNP分子标记的DNA条码。同时，利用SNP区分1000株以上的柑橘多胚杂交苗。

将500000条EST按物种或者无性系进行组装。改进QualitySNP预测算法，即剔除高度相似（>95%相似度）旁系同源的基因、剔除EST序列末端5’50bp和3’端300bp低质量序列、利用品种遗传背景限制单体型数量等，成功地将SNP预测准确度由75%提高到了95%以上。从这些EST中获得了可信度≥95%的SNP分子标记3万多个。.比较了单链构象多态性（PCR-SSCP）、等位基因特异PCR（PCR-ARMS）、高分辨率溶解曲线（PCR-HRM）等SNP实验分型方法，确定高分辨率溶解曲线分型技术是一种更优秀的SNP分型方法。.通过分析基因组中SNP密度和多个基因位的haplotype，结合系统发生学分析结果，明确了甜橙、克里迈丁和椪柑的起源和基因组构成：.1）克里曼丁与甜橙之间在每个位点均至少共有一个haplotype，证明克里曼丁是甜橙的后代。克里迈丁中非甜橙haplotype来自橘。通过在50个宽皮柑橘品种中对橘亲本的特征haplotype进行SNP分型筛选，确定该亲本是地中海橘。.2）分析359个基因位点上甜橙、克里曼丁、椪柑、酸橙、葡萄柚的两个等位基因的haplotype，得出甜橙基因组内橘柚杂合位点与橘橘杂合位点的数量比大约为3：1，拒绝前人提出的关于甜橙起源橘柚杂种说、橘柚杂种与橘回交说的假说, 提出甜橙的起源为[（柚X橘）X柚]X橘。.3）椪柑特征SNP代表的haplotype和系统发生结果显示17.8%的椪柑基因位点上含有一个柚子等位基因，表明椪柑并非是一个典型的宽皮柑橘，它的起源包含至少一次橘柚杂交后与宽皮柑橘多次回交事件。.以柚子为材料，研究利用SNP建立柚子品种的DNA条码。筛选9个不同连锁群上的31个SNP，用HRM技术对264个柚子材料进行了SNP分析分析，发现了181种不同的基因型。甄别了同物异名和异物同名现象。统计学分析显示，特征SNP的组合完全可以对柚子品种进行区分，适合作柚子品种的DNA条码。.利用SNP对红橘和少核莫科特的杂种进行了杂种苗的区分研究。测序分析双亲的CHX基因片段序列，获得父纯、母纯SNP位点，根据HRM特征曲线成功地在杂交群体中鉴别出杂交苗。.培养毕业硕士3名，在读硕士2名。完成论文6篇，其中重要的论文3篇。