荔枝SNP标记开发及其在杂种区分和遗传多态性研究中的应用

The breeding efficiency of litchi has been hindered by two problems. First, the phylogenetic relationships among the litchi germplasm are not clear, which makes it very difficult for breeders to select breeding parents. Second, no efficient tools are available for making earlier identification of sexual seedlings. Therefore, we propose this project to solve these problems. Our rationale is to develop high efficient SNP markers through mining the EST data which were obtained in our previous work and the genome sequence data which were from a joint team work involving us. We will test these candidate markers for their utility by means of single strand conformation polymorphism (SSCP), cleaved amplified polymorphic sequences (CAPS) and high resolution melting system (HRM) assay. The phylogenetic relationships of twenty sequenced litchi germplasms will be analysed by using these SNP data. A number of gene loci will be analysed for haplotype polymorphism, and tag-SNPs will also be identified for each haplotype. These haplotype-tagged SNPs, also called htSNP, will be used to distinguish individual germplasm accessions and develop a DNA barcode system for all existing litchi germplasms. The tag SNPs will also be used together with our previously obtained EST-SSR markers to identify true hybrids from the seedlings resulted from our breeding programs.

荔枝种质资源间亲缘关系不明，制约了荔枝杂交育种亲本的选配，加上缺乏有效的杂种早期区分技术，严重影响了杂交育种效率的提高。本项目研究拟利用本团队全程参与完成的荔枝全基因组重测序数据和独自获得的大量荔枝表达序列标签（EST）数据，通过生物信息学分析，从中高效甄别单核苷酸多态性（SNP）位点，筛查候选SNP标记；设计特异PCR引物，对20份以上已重测序种质基因组DNA采用单链构象多态性、限制性酶切片段多态性、高分辨率熔解曲线分析等检测技术，验证多态性SNP；分析已知基因的等位基因序列，筛选确定荔枝单倍型标签SNP（htSNP），结合本团队前期获得的近百个EST-SSR标记，分析评价现有荔枝种质间遗传多态性和亲缘关系；利用htSNP检测300份以上荔枝种质的10个以上SNP位点，建立起不同种质特有的DNA分子条码;应用SNP区分荔枝杂种苗。

荔枝种质和品种均是经长期自然杂交和实生繁殖而来,但其遗传背景不清、遗传多样性与亲缘关系不明，是长期以来阻碍育种技术进步和效率提升的首要关键问题；为克服杂交亲本选配的盲目性及建立对杂种后代进行早期选择的高效手段，以及弄清同名异物和同物异名的问题等，均急需开发高效可靠的分子标记检测技术，随着荔枝全基因组测序与代表性种质重测序工作的完成，以及生物信息学及功能基因组学理论和技术的进步，通过开发特异性SNP标记，高效检测种质间遗传差异及其差异的本质，技术准备已充分成熟。.本项目从荔枝EST序列和全基因组测序和重测序数据发掘SNP位点，在完善SNP检测技术（HRM、MALDI-TOF MS)的基础上，进行大量筛选与分析验证，获得在荔枝种质资源中多态性高、分型稳定111个SNP分子标记，已成功应用于荔枝种质亲缘关系分析、杂种鉴别、新种质与新品种的鉴定等，也已成功区分多个杂交群体上千株杂种实生苗，同时以SNP分型构建起已有种质共400多份材料的分子条码，通过产区多点重复取样验证了本研究建立的DNA分子条码的可靠性，为荔枝SNP分子标记技术的育种应用与产业化应用（新品种测试、品种权保护），建立起世界领先的技术平台；同时，发掘了多个荔枝极早熟性状关联位点及功能基因，为进一步开展重要性状分子辅助育种奠定了良好基础；此外，通过重测序数据分析，研究荔枝起源与进化，已确定荔枝有云南和海南荔枝两个独立进化的路径，明确了现有栽培品种均是二者驯化及其基因重组的后代，为荔枝遗传改良路径与种质创新利用指明了方向，具有重要的科学意义；最后，对荔枝优质品种‘御金球’果肉挥发性成分进行了前瞻性探索，明确了与其它品种的异同，为以果实品质性状目标扩展分子标记辅助选择奠定基础。通过本项目的实施，共发表论文8篇，其中SCI论文1篇，培养硕士生3名；在SNP分子标记技术上已与国际先进水平接轨，将极大地促进荔枝育种学科的发展。