一个新的RNA结合蛋白(MTA1)参与mRNA可变剪切调控的机制以及在肿瘤发生与进展中的作用

RNA alternative splicing is the basis for the complexity and variarity of cellular activities in higher organisms. Currently, the study on post-transcriptional mRNA processing is just on its starting line. Our pilot study has shown that MTA1 interacts with the ribonucleoproteins on most of the intracellular organelles involved in mRNA processing, including nucleoleus,nuclear membrane, cytoplasmic RNA particles and granules, which is supported by localization of MTA1 under microscopic observation. mRNA spliceosome is changed by MTA1 interference in cancer cells. Till now, no data on MTA1 in mRNA processing have been reported. In this proposal, we propose to identify the MTA1-inducedd spliseosome change and MTA1-binding mRNA sequence by the combinational analysis of the data from RNA-seq and diCLIP-seq. Further, we will also figure out the RNP complex containing MTA1 to regulate RNA splicing and the motif of MTA1 by which MTA1 interacts with other proteins in RNP. To testify the model established by systematic biology, we will confirm the splicing mechanism in the mRNAs of more than 10 genes at the levels of cell lines and MTA1 knockout mice. The role of MTA1 in mRNA alternative splicing will also be evaluated in human tumor samples. This study will create a new subfield for MTA1 research and further complete the molecular network for mRNA alternative splicing. This proposal is a new try marked by orginal creativity both theoreticaly and technologically.

mRNA可变剪切是高等生物生命活动复杂性和多样性的基础。目前对mRNA转录后调控的研究尚处于初期阶段。我们的研究显示转移相关基因1(MTA1)结合了大量RNA调控蛋白,在mRNA转录至翻译的整个过程的各个部位均有分布(从核仁-核膜-胞浆-核糖体- - RNA颗粒)，并且导致mRNA的可变剪切组改变。目前未见相关内容的报道。本研究拟从前期工作基础出发，采用diCLIP-seq和RNA-seq技术来系统鉴定MTA1蛋白结合的所有mRNA及其精确结合位点;鉴定MTA1在RNP复合体中调控mRNA可变剪切的蛋白结构域；并在可变剪切报告系统、MTA1基因敲除动物和人体肿瘤组织中进行多层次的验证，揭示MTA1蛋白在mRNA可变剪切中的生物学功能和分子机制。本研究的顺利实施将为MTA1的研究开辟一个新的领域，完善mRNA可变剪切调控的分子网络，并确定MTA1在网络中的位置，具有较高的理论创新性和技术创新性。

MTA1 是一个染色质重塑相关因子。目前越来越多的证据表明染色质重塑可以通过与RNA剪接因子或snRNP蛋白互作影响核小体的组装从而广泛参与RNA的可变剪接调控过程。在本研究中，我们发现MTA1作为染色质重塑和去乙酰化（NuRD）复合体的核心组成部分之一，在肿瘤细胞中与大量RNA结合蛋白（RBP）共表达，并且存在明显的物理相互作用。通过co-IP结合质谱技术我们发现，在结肠癌HCT116细胞中，MTA1与pre-mRNA加工间接相关因子具有明显的相互作用，包括旁斑因子NONO，剪接体组装复合体SMN1/GEMINs, 以及前体mRNA加工剪接调控因子HnRNPs等等。 为了研究MTA1及其复合体蛋白与靶标RNA的互作，我们在CLIP技术的基础上，进一步引入了甲醛交联技术（fCLIP）， 用来研究HCT116细胞中MTA1所结合的靶标RNA分子及其结合特征。我们发现MTA1可以与大量的前体及成熟mRNA结合，其对应的基因主要富集于细胞周期M期调控，凋亡，已经侵袭转移等功能。通过CRISPR/CAS9对HCT116细胞中的MTA1进行敲除后发现，MTA1可以显著影响mRNA的转录及加工剪接过程，该调控功能与MTA1的RNA结合功能高度相关。另外，我们发现这些调控基因显著指向于有丝分裂及纺锤体运动调控，提示MTA1具有调控有丝分裂的新功能。进一步亚细胞定位研究表明，MTA1在细胞周期的有丝分裂期定位于纺锤体微管上，并且随着纺锤体的运动而运动，呈现周期性地定位模式。当利用微管损伤剂对细胞进行M期阻滞时，我们发现MTA1可以促进细胞跨过M期阻滞，但是该效应可以导致异常的有丝分裂时相，并最终导致染色体不稳定性，从而促进肿瘤的发生。概括所述，我们以为MTA1作为一个促癌基因的新机制，它可以通过与RNA结合蛋白互作，参与mRNA的转录后调控事件，而这些调控事件可以通过有丝分裂调控机制促进肿瘤的发生。