一氧化氮调控家榆种子线粒体依赖性细胞死亡机制的研究

Seed deterioration is a major problem in conservation of germplasm resources. Although a lot of work has been done by predecessors, the mechanisms have not been clarified. In preliminary study, applicants found reactive oxygen species (ROS)-induced mitochondrial dependent programmed cell death (PCD) exists during Ulmus pumila L. seed deterioration, and nitric oxide (NO) may participate in regulation of PCD. In this project, we will use confocal laser scanning microscope, transmission electron microscope, pharmacological and biochemical methods to analyze the dynamic distribution of NO during seed deterioration, the influence on mitochondria morphology and function by NO, and the relationship between NO and mitochondrial ROS during seeds ageing. Biotin Switch assay, isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) will be used to find the S-nitrosylated proteins in mitochondria located in the key nodes controlling seed vigor, and determine S-nitrosylation site of candidate proteins. Then bioinformatics tools was used to predict the mechanisms of NO regulated seed vigor via mitochondrial will be revealed. This study is expected to provide theoretical basis and technical strategy for long-term preservation of germplasm resources.

种子老化劣变是种质资源保存所面临的严重问题。虽然前人已做了大量工作，但机理尚不明确。申请人前期研究发现家榆（Ulmus pumila L.）种子老化过程中发生了活性氧（ROS）诱发的线粒体依赖性细胞程序性死亡（PCD），一氧化氮（NO）可能参与调控了种子PCD的过程。本课题以家榆种子为试材，通过激光共聚焦扫描显微镜和透射电子显微镜观察，结合药理学和生化方法，分析种子老化过程中NO含量变化与动态分布、NO对线粒体形态和功能的影响，探讨老化过程中NO和线粒体ROS产生的内在联系；Biotin Switch法联合iTRAQ技术筛选处于种子活力调控关键节点的线粒体S-亚硝基化蛋白，生物信息学手段预测NO通过线粒体调控种子活力的机制，为种质资源的保存提供理论依据和技术策略。

种子老化是种质资源保存所面临的重要问题。探索种子老化的分子机理和优化种子贮藏方法是科学研究所面临的一大挑战。研究表明，重要气体信号分子一氧化氮（Nitric oxide，NO）在植物缓解胁迫和延缓衰老过程中起着重要作用，但是其是否参与种子老化的调控目前还尚未见报道。本研究以家榆（Ulmus pumila L.）种子为实验材料，对NO调控种子老化的机制进行研究。主要研究内容和结果如下：NO供体和抑制剂处理家榆种子结果表明，NO可以延缓老化过程中家榆种子活力的丧失。TTC染色结果显示，NO可以延缓家榆种子老化过程中的细胞死亡。DNA laddering和Caspase-3酶活检测结果表明，NO可以延缓家榆种子老化过程中的PCD过程。用代谢组的方法检测了老化前后及NO处理前后种子的差异代谢物。对6种处理的代谢组进行比较发现，有550种受老化影响显著的潜在标志代谢物，其中244种代谢物老化后显著提高，306种代谢物显著降低。371种代谢物受NO影响显著，其中155种代谢物上调，216种代谢物下调。163种受老化调控的代谢物可以被NO所调控，表明NO可能参与种子老化的调控。为了研究NO介导的蛋白质S-亚硝基化修饰是否在种子老化过程中起作用，用Saville-Griess法和Biotin-Switch法分别检测了老化种子中SNO基团和S-亚硝基化蛋白的含量。结果显示二者变化与NO含量的变化趋势相一致，表明NO引起的S-亚硝基化修饰可能参与种子老化的调控。检测老化种子的S-亚硝基化蛋白质组，发现了82种S-亚硝基化蛋白，其中有11种为糖代谢相关蛋白。同时发现在动物细胞死亡过程中起重要作用的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）也发生了S-亚硝基化。为了研究GAPDH是否参与家榆种子老化过程中细胞死亡的调控，克隆了UpGAPDH基因，用Overlap的方法将UpGAPDH的三个Cys进行点突变，原核表达并纯化了四种UpGAPDH蛋白。用Biotin-Switch法检测了四种蛋白的S-亚硝基化修饰程度，发现UpGAPDH有且仅有一个S-亚硝基化修饰位点——C154。综上所述，本文建立了NO通过转录调控和翻译后修饰延缓家榆种子老化过程中细胞死亡的模型。此研究将为进一步探索NO调控植物细胞死亡的分子机制奠定基础。