氨氧化古菌对农田土壤氧化亚氮释放的贡献及其作用机制

Nitrous oxide is a kind of important greenhouse gas after carbon dioxide and methane, its large emissions is threatening to natural ecosystems and human beings. As yet, agricultural soils are known to be the main source of nitrous oxide, and the nitrification and denitrification in soils by ammonia-oxidizing bacteria (AOB) contribute to amount of nitrous oxide. Ammonia-oxidizing archaea (AOA) is a novel ammonia oxidizer, which was found in recent years, are widely distributed in all kinds of ecosystems on the earth. All of the researches suggested AOA takes a important role in nitrogen biogeochemical cylcing. Recently, AOA was found to have ability of nitrous oxide emission during ammonia oxidation, and could be the main source of nitrous oxide in ocean. In addition, the key genes code for functional enzymes of denitrification are found in all of the AOA genomes. As above, we suppose AOA also have a important role in nitrous oxide emission in soils. In this research project, we will study the contribution of AOA to nitrous oxide emission in paddy soils by stable isotope labelling, and reveal the mechnisms of AOA to nitrous emission via AOA cell research level, gene level, and functional gene transcription level, and microbial ecology level of AOA with other nitrogen cycling microorganisms in the soils. The results of this research project are meaningful for the development of nitrogen biogeochemistry, and helpful for the controlment and decreasement of nitrous oxide emission from agricultural soils, and enhancing the availability of nitrogen fertilizer.

N2O是仅次于CO2和CH4的温室气体，其大量排放对自然生态系统和人类生存环境造成严重威胁。农田土壤是N2O的主要来源，氨氧化细菌(AOB)通过硝化和反硝化途径产生的N2O是其中的重要组成部分。氨氧化古菌(AOA)是近年来发现的氨氧化微生物，广泛分布于地球各生态系统中，对全球氮循环起重要作用；已有研究表明AOA在氨氧化过程中产生N2O，可能是海洋N2O释放的关键源，而且所有AOA的基因组中均发现编码反硝化酶的关键基因，因此，我们推测AOA可能对土壤N2O的释放起重要作用。本项目以稻田土壤为研究对象，通过稳定同位素标记研究AOA对土壤N2O释放的贡献，并通过AOA细胞水平、基因水平、功能基因转录水平、以及AOA与土壤中其它氮循环微生物间的生态学关系的研究揭示AOA贡献土壤N2O的机制。本项目的实施对丰富氮的生物地球化学循环有重要意义，对控制和减少农田N2O排放，提高氮肥利用率具有参考价值。

氮肥的使用是导致农田土壤中N2O释放的关键因素，其来源是土壤中氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)驱动的氨氧化作用及硝化-反硝化作用。目前关于农田土壤中AOA对N2O的贡献及其作用机制仍不明确，基于细胞水平的研究是解决这些问题的关键。然而，从土壤中获得的AOA菌株和富集物只有7个左右，国内至今没有相关报道，这极大地限制了我们深入开展相关研究工作。因此，为了从农田土壤中获得高丰度AOA富集物乃至AOA纯培养物，本项目通过长期的探索，设计并优化了一种可以快速获得高丰度AOA富集物的两步法策略：第一步，根据高通量或定量PCR分析选择AOA丰度较高的土壤样品，以不含抗生素的培养基启动富集培养，当检测到亚硝氮生成后，转入后续的传代培养，以氨苄青霉素和卡那霉素为选择压力抑制细菌，并加入石英砂为AOA细胞的吸附介质，每次收集石英砂进行传代培养；第二步，当石英砂上AOA丰度达到30%时，以阿奇霉素和环丙沙星为选择压力抑制细菌，培养2-3代即可获得高丰度的AOA富集物。利用该策略，我们只用了150 d即获得了丰度大于96%的AOA菌株Ca. Nitrosocosmicus sp. SS，该AOA可以耐受高浓度的氨氮，在100 mM和200 mM的氨氮中仍可维持~63%和~25%的氨氧化活性，是目前发现的氨氮耐受性最高的AOA菌株；此外，该AOA还可以耐受高浓度的亚硝氮 (> 50mM)，并可利用尿素为能源物质进行生长。同样地，我们只用了不到100 d又从新的农田土壤样品中获得了丰度大于90%的AOA菌株，从而验证了我们设计的两步法策略的可行性。以往报道的AOA菌株的富集时间一般需要1-7年，而我们设计的两步法策略极大地缩短了AOA富集的时间，降低了AOA富集和培养的难度，为AOA的研究和应用提供了大量的材料。尽管我们未能全部完成项目预期的研究工作，但基于已获得的高丰度AOA富集物，通过细胞水平以及基因组测序分析揭示AOA对N2O释放的贡献及其作用机制，在短期内即可完成。此外，不同于以往的AOA菌株，我们获得的AOA具有高氨氮耐受性，基于这些菌株研究农田土壤中AOA对N2O释放的贡献可能产生新的认识。