硫化氢促进角质形成细胞迁移改善糖尿病伤口愈合及机制

Delayed wound healing (DWH) is a severe complication of diabetes mellitus (DM), whose etiopathogenisis is involved in the suppressed migration of kerotinocytes (KC) and oxidative stress (OS). Hydrogen sulfide (H2S) can enhance migration of endotheliocytes and neutrophils. Our recent study showed that H2S protected KC against hypoxia-induced OS injury. The current study aims to examine whether H2S can be used to prevent and cure DWH in DM. KC is exposed to high concentration of glucose (HG) to establish a cellular model of DWH in DM. Intracellular H2S level and its synthetase expressions are detected. By alteration of the synthetase expressions by transgene and RNA interference, HG-induced suppression of KC migration was further examined comparing with wild-type KC. To measure ROS-induced Rac1 (a GTPase) activation and matrix metalloproteinase (MMP-1, 2 and 9) expressions, and to use relative inhibitors, the mechanisms underlying H2S-induced migration of KC can be revealed. On the basis of the above study, the DM rats are applied to evaluate the therapeutic effect of H2S on DWH. By this project, it is expected to discover a novel therapeutic target for the DMH in DM.

皮肤伤口愈合障碍是严重影响糖尿病（DM）患者生活质量的重要并发症，高糖诱导的角质形成细胞（KC）迁移抑制和氧化应激(OS)是其重要病因。气体信号分子硫化氢（H2S）可增强内皮细胞和中性粒细胞的迁移功能。前期研究发现，H2S可保护KC对抗缺氧诱导的OS损伤。本项目旨在探讨H2S可否用来防治DM皮肤伤口愈合障碍及机制。拟用高糖处理KC建立DM伤口愈合障碍的细胞模型，检测内源性H2S及其合成酶的水平，通过基因转染和RNA干扰改变其合成酶的表达，明确其对高糖抑制KC迁移的调控。通过检测OS介导的小GTP酶Rac1激活，以及基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-2和MMP-9的表达并用其相应的拮抗剂，揭示H2S对抗KC迁移抑制的分子机制。进一步在整体动物水平评价H2S对DM大鼠伤口愈合的促进作用及机制。本项目的开展可望为以H2S为视角的DM伤口愈合障碍的防治提供新的靶点。

糖尿病（DM）是常见病，在我国成人发病率高达10%，伤口愈合障碍是其主要并发症，约占DM总数的1/3。因而，DM伤口愈合障碍的防治具有重要的现实意义。硫化氢（H2S）具有抗炎、抗氧化、调节血管新生、清除丙酮醛等作用，理论上可以用于DM伤口愈合障碍的治疗。本研究与美国华盛顿州大学化学教研室合作，设计并合成了释放可控的、化学稳定性高的H2S供体，NSHD-1。本项目在糖基化终末产物（AGEs）的中间体丙酮醛（MGO）诱导的人皮肤角质形成细胞（HaCaT）损伤模型，观察了NSHD-1的保护作用。发现MGO处理可降低HaCaT细胞活力，而在MGO处理前给予NSHD-1预处理可明显抑制MGO诱导的损伤作用；另外，NSHD-1预处理还可通过抗氧化，抗凋亡，改善线粒体功能等方式拮抗MGO诱导的损伤效应。重要的是，MGO处理可导致HaCaT细胞行为学功能损伤，包括粘附功能和迁移功能的下降，而NSHD-1的预处理可明显改善细胞的粘附和迁移功能。此部分成果已在Cell Physiol Biochem发表。在项目实施过程中，通过阅读文献了解到：DM皮肤伤口愈合障碍的早期常表现为周围神经功能减退、营养作用下降，进而影响伤口愈合过程。因此，我们在周围神经RSC96施万细胞观察了MGO的损伤效应，与HaCaT皮肤细胞类似，MGO也可引起明显的损伤作用，表现为细胞活力降低，iNOS/NO信号通路的过度激活以及ONOO的堆积。值得注意的是，MGO处理也明显抑制了内源性H2S的生成。Meta分析发现VitD缺陷与DM周围神经病和皮肤伤口愈合障碍密切相关。因此我们观察了VitD对MGO诱导的RSC96细胞损伤的影响，发现其可明显减轻这种损伤效应，机制与恢复内源性H2S水平有关。基于VitD是临床常用药，又可部分恢复内源性H2S的水平，这为以后以H2S为靶点的DM伤口愈合障碍的防治提供了基础资料。此部分结果发表于Neurochem Int杂志。关于整体动物实验，目前已经成功建立DM高血糖模型并建立了小鼠背部伤口，但仍未拿到DM伤口愈合障碍的结果，我们考虑可能是四氧嘧啶引起的T1DM的高血糖过程不够长，或胰岛功能恢复导致实验不稳定，因而又向南京大学订购了db/db的自发性糖尿病小鼠，目前还没有到货。在项目的实施过程中，我们应用H2S荧光探针检测细胞产生H2S能力，因此法简单易行，已申请发明专利。