TetR家族转录因子SPA7074对生防菌ACT12中次级代谢产物合成的调控研究

Streptomyces pactum Act12 was isolated from soil sample of Tibetan plateau during screening of biocontrol actinomycetes. Its microbial agents exhibit varying degrees of antagonism against soil-borne pathogenic fungi commonly observed in fields, as well as promoting the growth of strawberries and melons. spa7074,which is located nearby one possible cryptic gene cluster, encodes a protein homologous to transcriptional repressors of the TetR family. Disruption of spa7074 in ACT12 result in stronger ability antagonistic to pathogenic fungus. Analysis of secondary metabolites by HPLC revealed that a new combine was synthesized remarkably in disrupted strain. This project aimed to isolate and identify the combine and research the regulation mechanism of SPA7074 on the secondary metabolism in ACT12. The study will provide both theoretical instruction and practical instruction for the activation of silent gene cluster to discover novel natural products. The successful execution of this project will certainly expand agricultural applications of the multifunctional biocontrol strain.

ACT12是本室早期分离并已用于农业生产的西北特境生防菌，可防病促生、诱导植物抗性并降低连作障碍，但活性机理未明。spa7074位于一可能编码新型化合物的隐性基因簇边缘，可能编码TetR家族转录因子，课题组通过双交换构建的spa7074缺失突变株对病原菌平板拮抗能力显著增强，发酵液成分HPLC分析出现一显著差异峰。本项目拟在此基础上展开进一步研究，通过色谱技术与核磁技术分离鉴定差异峰所对应化合物，通过生物信息学结合分子与生化实验鉴定其生物合成基因簇，并通过实时定量PCR、凝胶阻滞试验、S1 核酸酶作图等技术研究SPA7074对次级代谢基因簇的转录调控机制，另一方面通过作物栽培实验检测重组菌株的生防活性加强的实践效果。本项目的开展一方面可以了解ACT12活性机理，另一方面可以探讨通过基因工程手段改变生防菌代谢调控获得高活性生防个体用于农业生产的理论与实践意义，为该类生防菌的改造提供参考。

本项目从一株多活性生防菌Act12出发，构建了TetR家族转录因子SPA7074的缺失突变株，发现突变株代谢图谱发生了明显的变化，出现了显著差异代谢产物峰，且抑菌活性显著提高。说明SPA7074可能在生防菌ACT12的次级代谢中起调控作用。我们对差异代谢峰进行了鉴定，结果表明其为二十六元环大环内酯类抗生素寡霉素D，在Act12全基因组序列中也找到了寡霉素D的生物合成基因簇，该基因簇在染色体上的位置与SPA7074相距较远。通过EMSA等实验结果表明，SPA7074并不直接作用于寡霉素生物合成基因簇内的转录单元，因此我们对野生型Act12及SPA7074缺失突变株及过表达突变株进行了代谢组和转录组测定。生物信息学分析及EMSA实验表明CRP_Fnr家族转录因子CF235可能是SPA7074的潜在作用靶标，SPA7074通过调控CF235的转录间接调控寡霉素的生物合成。另外，我们还对重组菌的生防活性分别进行了盆栽及大田实验检测，结果表明突变株的抑菌及促生活性均得到明显增强。转录组分析还发现ACC脱氨酶的表达量在SPA7074确实突变株中显著提高，这可能是突变株促生活性得以提高的原因之一。本项目的研究一方面对Act12活性机理及其调控机制有了初步的了解，为进一步开发Act12的生防应用潜力提供了理论基础，另一方面实验结果也表明利用基因工程手段改变生防菌代谢调控获得高活性生防个体用于农业生产是可能性的，可为该类生防菌的改造提供参考，具有很好的理论与实践指导意义。