调节性T细胞调控协同刺激分子B7-1/B7-2在PBC中的作用及机制研究

Primary biliary cholangitis (PBC) is a common autoimmune liver disease. Recent reports show regulatory T cells (Treg) is involved in the onset of PBC. Treatment of wild-type normal Tregs could significantly alleviate PBC-induced portal inflammatory and bile duct damage, but the pathogenesis is still obscure. In our previous studies, we found that a significant decrease in the number of Treg in the peripheral blood and an increased expression of costimulatory molecules B7-1/B7-2 in the peripheral blood and liver of the PBC patients compared to the healthy controls. And there is a higher expression of B7-2 in liver of CD25 deficiency mice. However, the pathogenesis still needs to be further studied. In this research project, by using flow cytometry, adoptive transfer, target genes overexpression and siRNA-dependent silence as well as PBC mouse model, and Treg suppression assay, cytotoxicity and proliferation assay of T cell，we aim to study and determine CTLA-4-dependent Treg cells down-regulate the expression of B7-1/ B7-2, reduce the activation of T cells, the production of inflammatory cytokines and cytotoxicity against the biliary epithelial cells via interfering with PI3K/AKT/NFκB pathway which implicates the progression and molecular mechanism, provides new ideas for clinical treatment of PBC.

原发性胆汁性胆管炎（PBC）是常见的自身免疫性肝病。近年报道调节性T细胞（Treg）与PBC发病密切相关。野生小鼠正常的Treg细胞干预可显著缓解PBC引起的汇管区的炎性浸润和胆管损伤，但其机制尚不明确。我们前期研究发现，与健康对照相比，PBC患者外周血Treg细胞数量显著减少，协同刺激分子B7-1/B7-2的表达在外周血及肝组织中显著升高；且CD25-/-小鼠肝脏也出现了B7-2的表达升高，但其机制仍需进一步研究。本项目拟在前期研究的基础上，采用流式细胞术、过继转移、靶基因过表达与siRNA沉默等技术以及PBC动物模型、Treg细胞抑制实验、T细胞杀伤和增殖实验，探讨并确定Treg细胞依赖CTLA-4下调B7-1/B7-2表达，从而干扰PI3K/AKT/NFκB通路激活，减少T细胞的活化和炎症因子的产生及对胆管上皮细胞的杀伤作用参与PBC发病的作用及分子机制，为PBC临床治疗提供新思路。

研究背景 .原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种自身免疫性肝脏疾病。组织学上以小叶间胆管进行性损伤表现为主；血清中出现碱性磷酸酶和特异性的M2型抗线粒体抗体。近年来报道调节性T细胞（Treg）和自然杀伤T细胞（NKT）与PBC发病过程相关。 .主要研究内容: .通过收集和分析PBC患者样本，并用检测外周血中Treg，NKT细胞的比例，数量检测相关细胞因子水平。分离出样本中的单个核细胞，分选培养以通过体外实验检测其功能，以发现这两种细胞在PBC发病中的作用和相互关系。.重要结果: .研究发现，PBC患者的Treg数量和产生IL-10的能力都显著下降；PBC患者的Treg难以有效抑制T细胞的增殖和IFN-γ的产生，Treg具有抑制T细胞对胆管上皮细胞的杀伤的能力，PBC患者的Treg细胞的这种抑制能力低于健康对照组；另外，PBC患者CD1c+表面的B7-1/B7-2分子显著增高并且在自身抗体刺激后上升更为显著；PBC患者的Treg抑制DC表面B7-2的表达能力显著减弱。PBC患者PBMC抑制肝星形细胞表达的α-SMA能力减弱。.IL-17A及其相关上下游细胞因子水平在PBC患者外周血中均上升；在PBC患者外周血中CD3+CD56+ NKT细胞数量显著上升；而经典T细胞（CD3+CD4+/CD8+）的数量与健康成人无明显差异。胞内染色结果显示CD3+CD56+NKT细胞是产生IL-17A最多的一群细胞；用分离的自身抗体刺激PBMC后，上清中IL-17A水平显著上升，并且上升最多的来源即为CD3+CD56+NKT细胞；IL-17A可以使肝星形细胞活化产生转化生长因子TGF-β和α-SMA，且呈剂量依赖，PBC患者的PBMC可使肝星形细胞活化产生更高水平的TGF-β。.关键数据及科学意义.在PBC发病过程中Treg数量，比例和功能的下降，导致其抑制树突细胞活化和炎症发生的能力显著降低；与此同时，NKT细胞在自身抗原等刺激下产生IL-17A，促进肝星形细胞活化，使PBC纤维化进一步发展。本课题的完成不仅可阐明Treg细胞调控B7-1/B7-2抑制PBC发生发展的机制，也可为PBC临床治疗及新药研发提供新理念，具有较高创新性及医学意义。