一种新型海洋细菌中性内切葡聚糖酶的适冷和热稳定机制的研究

中性内切葡聚糖酶在纺织工业具有重要的应用价值，但现有酶普遍存在低温时活性差、热稳定性低等缺点，严重制约了其工业化应用。申请人从海洋细菌Cellulophaga sp. QY201中纯化到一种新型中性内切葡聚糖酶CelA，该酶不但在低温时活性高，而且具有很好的热稳定性。在前期研究的基础上，本项目旨在克隆CelA的编码基因，确定其所属糖水解酶家族，阐明其在进化上的意义；通过CelA的一级、二级和三维结构分析，并与同源适冷酶和中温酶进行比较，推测与适冷性和热稳定性相关的氨基酸残基和特殊结构；利用定点突变技术构建突变体，通过与野生酶的酶学性质和催化动力学的比较来加以确证，从而揭示CelA的适冷机制和热稳定机制。本项目将深化对酶的适冷性、热稳定性与结构之间关系的理解，为适冷酶的改造与应用提供理论依据；丰富糖水解酶的多样性，推动酶学、糖生物学的深入发展。

中性内切葡聚糖酶在纺织工业和洗涤剂行业具有重要的应用价值，但现有酶普遍存在低温时活性差、热稳定性低等缺点，严重制约了其工业化应用。从海洋细菌Cellulophaga sp. QY201中纯化到一种新型中性内切葡聚糖酶CelA，利用简并PCR和本利用反向PCR克隆到CelA的编码基因celA，全长1080 bp，编码359个氨基酸，理论分子量和等电点（pI）分别为40.80 kDa和4.7。根据其序列相似性将其归为糖水解酶第5家族。通过对CelA序列及三维结构的分析，并与同源适冷酶Cel5G和中温酶Cel5A进行比较，推测出与催化、底物结合、适冷性和热稳定性相关的氨基酸残基。利用定点突变技术构建了19个突变体，通过与野生酶的酶学性质和催化动力学的比较，确定Glu141为质子供体，Glu229为亲核体，Trp39、Trp42、Tyr210、Tyr235是重要的底物结合位点，Asp104是决定CelA适冷和热稳定的重要氨基酸残基，将其突变成Asn后，负电荷数目减少，但最适温度降低10 ºC，温度稳定性降低。以前的研究认为，低温酶的负电荷比一般的中温酶高温酶多，导致在低温下活性高，温度稳定性差。通过本项目的研究，我们发现了一种与以前研究不同的适冷机制。今后，我们将继续进行纤维素酶CelA结构的研究，以期进一步阐明其结构与功能之间的关系，并将该适冷机制用于改造其他海洋多糖降解酶。