心肌梗死后iNOS对自噬功能调节在心肌瘢痕组织形成中的作用

Myocardium infarction and subsequent heart failure are the main causes of cardiovascular mortality. Cardiac fibrosis and scar formation play key roles in the pathogenesis of heart failure. However, due to the lack of the understanding on the mechanism of cardiac scar formation, there is no specific therapy currently available. Autophagy is recently identified as an important mechanism by which damaged cell organelles are cleared to avoid inflammatory injury. But it remains unknown whether autophagy dysfunction participates in the process of scar formation after myocardium infarction. Our preliminary studies show that marked inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression occurs in infarcted myocardium and NO can inhibit autophagosome formation. We thus hypothesize that the massive NO production from iNOS in infarcted myocardium suppresses autophagy function, this then causes persistent inflammatory responses and hence promotes scar formation. We will examine this hypothesis with isolated cardiomyocytes and transgenic mice. These studies will demonstrate the regulatory roles of iNOS in autophagy formation, reveal the molecular details underlying the inhibitory effect of NO on autophagy, and establish the iNOS modulation of autophagy as a novel mechanism of myocardium scar formation after infarction. The findings from these studies may provide important evidence to demonstrate that intervening the iNOS-autophagy pathway may be a new therapeutic approach to mitigate or prevent cardiac scar formation after myocardium infarction.

心肌梗死后继发性心力衰竭是心血管疾病致死的最主要原因。心梗后心肌纤维化和瘢痕组织生成是诱发心衰的重要病理变化，但由于对心肌瘢痕生成的机制缺乏了解，目前尚无针对性的治疗措施。自噬体是清除受损细胞器，避免过度炎症反应的重要机制，是当前细胞损伤研究的新生长点。心梗后心肌瘢痕组织生成是否与心肌细胞自噬功能受抑制有关尚不明确。我们的预实验发现心梗组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)大量表达，且NO能明显抑制自噬体形成。因此，我们提出心梗后iNOS产生过量NO，后者抑制自噬体功能使得受损心肌组织发生异常和持久的炎症反应，促进瘢痕组织生成的研究假说。本项目拟通过细胞水平与转基因小鼠的交叉研究，明确iNOS对心肌细胞自噬功能的调节，阐明NO抑制自噬体的分子机理，从而揭示iNOS对自噬功能的影响及其在心梗后瘢痕组织生成中的作用，为将iNOS-自噬体通路作为一种新型预防或延缓心肌瘢痕组织生成的治疗途径提供依据

自噬体是清除受损细胞器，避免过度炎症反应的重要机制。梗死后的心肌组织中，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)大量表达并产生过量NO，继而明显抑制自噬体形成，引起组织异常和持久的炎症反应。这可能是心梗后瘢痕组织生成的一个重要机制。因此，本课题在细胞水平与转基因小鼠的平台上，通过对比心梗组和假手术组的iNOS表达及NO生成水平，对心梗后iNOS表达与自噬功能调节、及心肌瘢痕组织形成三者间的关系做了初步研究。 . 首先，我们在C57BL小鼠心脏上成功制作了在体心肌梗死模型。随后，通过免疫印迹法检测到心梗组织中iNOS表达显著上调。并且通过检测自噬体标记蛋白LC3-Ⅱ水平，发现心梗组织中自噬体形成受到抑制。为了明确NO过量生成与自噬功能受抑制之间的关系，我们分离小鼠心肌细胞并加入NO供体SNAP(1-50 uM),发现NO剂量依赖性地降低心肌细胞LC3-Ⅱ水平，提示心梗后iNOS表达上调及过量NO产生是导致心梗后自噬功能下降的相关机制。除iNOS外，eNOS也是心肌中一个重要的NO来源, 其活化后产生的NO亦可能影响心肌自噬体功能。我们用选择性抑制剂以及siRNA分别特异性的阻断Thr308或Ser473磷酸化，结果发现eNOS Ser1179磷酸化状态与Thr308激活的Akt相关，而与Ser473磷酸化状态关系不大。这一发现证明了Akt Thr308，而非Ser473，其位点磷酸化对eNOS活化起关键调控作用。此外，为了探寻人类心梗时组织自噬功能改变的能量基础，我们将正常人和心梗患者血清代谢物组学的变化进行了比较，发现两者有着完全不同的代谢组学特征，并最终筛选出了9个标志性的代谢产物。. 综合上述结果，本研究为iNOS-自噬体通路作为一种新型预防或延缓心肌瘢痕组织生成的治疗途径奠定了坚实的工作基础。同时又延伸探索了eNOS活化的相关调控靶点，及心梗患者血清中发生的代谢组学变化。本项目资助发表SCI文章2篇，待发表3 篇SCI（正在撰写和投稿中）。培养硕士生5名，均已取得硕士学位。项目投入经费70万元，实际支出57.5万元，各项支出基本与预算相符。剩余经费12.5万元将用于本项目研究后续支出。