蛋白质巯基亚硝基化调控内质网应激参与耳蜗毛细胞声损伤的作用机制及干预研究

Endoplasmic reticulum stress (ER stress) in cochlear cell can be induced by noise exposure, however, the underlying molecular mechanism remains unknown. We found that the level of S-nitrosylated proteins in cochlea was significantly increased after noise trauma while this expression pattern was consistent with the expression of ER stress marker GRP78 and CHOP. Thus, we hypothesize that that S-nitrosylation of ER chaperone PDI and sensors PERK and IRE1α trigger ER stress, and then result in cell death in cochlea after noise exposure. We plan to study the characterize of S-nitrosylation using biotin-switch assay and ER stress associated apoptosis in noise-induced hearing loss through cell and murine model. We also aim to study the effect of S-nitrosylation on ER stress through modulating the expression of the key denitrosylation enzyme-GSNOR using with canalostomy with AAV in noise-induced hearing loss . This program will help us to understand the pathogenesis of noise induced hearing loss and offer new therapy.

研究表明噪声暴露可诱导耳蜗细胞内质网应激的发生，然而其调控机制尚不清楚。我们前期研究发现，噪声暴露后耳蜗细胞蛋白巯基亚硝基化水平明显增高，且与内质网应激标志物 GRP78和CHOP的升高具有时间一致性。我们假设，噪声暴露后耳蜗细胞内内质网伴侣蛋白和感受蛋白发生异常巯基亚硝基化修饰，诱发内质网应激，从而介导细胞损伤引发噪声性耳聋。本课题拟通过细胞与小鼠噪声性听力损伤模型：利用Biotin-Switch技术研究耳蜗细胞蛋白巯基亚硝基化修饰特征；探索受巯基亚硝基化影响的内质网相关蛋白；并利用内耳显微注射技术以腺相关病毒（AAV）为载体靶向调控内耳蛋白质巯基亚硝基化水平，探索其对内质网应激及其相关凋亡的影响。本课题旨在阐明噪声暴露所致听力损失中耳蜗细胞蛋白巯基亚硝基化调控内质网应激致细胞损伤的作用，为噪声性耳聋临床提供基于机制的治疗靶点和思路。

噪声暴露是导致听力损失的重要因素，噪声可引起耳蜗中细胞代谢异常，诱发生成大量未折叠蛋白，导致内质网应激发生。研究发现噪声性聋发生不仅与蛋白质的丰度相关，也被各类蛋白质翻译后修饰所调控。蛋白巯基亚硝基化属于蛋白翻译后修饰的一种，可调控多种生物进程。我们前期研究发现噪声暴露后耳蜗细胞蛋白巯基亚硝基化水平明显增高，且与内质网应激标志物GRP78和CHOP的升高具有时间一致性。本课题研究发现在噪声暴露后2、6、24小时均能检测到蛋白巯基亚硝基化水平增高，予以外源性一氧化氮抑制剂可降低内质网应激发生水平，同时减轻噪声暴露后听力阈值改变。体外予以内质网应激诱导剂衣霉素可以剂量依赖性通过诱导内质网应激引起HEI-OC1细胞凋亡。利用蛋白质组学及TMT标记蛋白巯基亚硝基化组学研究发现噪声暴露后6小时耳蜗细胞中共鉴定出具有统计学意义的78种蛋白上调、41种蛋白下调，蛋白巯基亚硝基化修饰改变5种蛋白；噪声暴露后24小时共鉴定出具有统计学意义的79种蛋白上调、50种蛋白下调，蛋白巯基亚硝基化修饰改变10种蛋白。结果表明，在噪声性耳聋中，噪声暴露后早期即发生蛋白巯基亚硝基化修饰，通过下调蛋白巯基亚硝基化水平可减轻耳蜗毛细胞的损伤。本项目研究成果为噪声性耳聋的防治开创了新思路。