RNA干扰抑制STAT3表达以增强防龋DNA疫苗粘膜免疫效果研究

本研究目的是构建小鼠STAT3基因的siRNA真核表达质粒，通过鼻粘膜途径与靶向防龋DNA疫苗同时免疫，降低粘膜树突状细胞和粘膜上皮细胞的STAT3表达，促进粘膜树突状细胞的成熟，克服粘膜免疫耐受，加强靶向防龋DNA疫苗粘膜免疫效果。本研究将利用分子克隆技术和真核细胞siRNA表达技术，设计和构建小鼠STAT3基因的siRNA真核表达质粒并检测其抑制STAT3基因表达的效率。通过鼻粘膜途径与防龋DNA疫苗同时接种免疫，利用抗体和细胞因子检测技术、定菌鼠模型，检测该免疫方式诱导特异性抗体和抑制龋病的能力。以基因芯片、定量PCR等技术分析小鼠STAT3基因的siRNA真核表达质粒转染树突状细胞后，被转染的树突状细胞的基因表达变化，以免疫组化、原位杂交等技术分析该免疫方式对免疫局部和粘膜相关淋巴组织的细胞组成，微环境的影响，探讨抑制STAT3表达增强防龋DNA粘膜免疫效果的可能机制。

龋病是人类最为常见的口腔疾病。变形链球菌是人类龋病的主要致病菌，其重要致龋毒力因子表面蛋白(surface protein antigen，PAc)和葡糖基转移酶(glucosyltransferaes，GTFS)起了主要作用。我院已研制了多种防龋DNA疫苗，分别是针对PAc的pCIA-P、同时针对PAc和GTFs的pGLUA-P和增加了树突状细胞靶向分子的靶向防龋DNA疫苗pGJA-P，经粘膜途径免疫定菌鼠后可以诱导产生唾液特异性SIgA抗体，具有防龋效果。目前防龋DNA疫苗的研究面临的问题主要是如何进一步提高疫苗免疫原性。树突状细胞在特异性免疫反应的诱导中起了关键作用。在粘膜免疫系统微环境中，通常都含有较高浓度的来自粘膜上皮细胞，树突状细胞和调节性T细胞的IL-10，IL-6和TGF-β，形成了一个免疫抑制环境，STAT3属于信号传导与转录激活因子蛋白家族，研究证实肿瘤细胞中高表达的STAT3也促进了多种免疫抑制因子的表达包括IL-10和VEGF，从而抑制了树突状细胞的成熟和抗肿瘤免疫反应的诱导。我们期望抑制粘膜上皮细胞及树突状细胞STAT3基因表达，能够降低粘膜微环境中免疫抑制因子的水平，有利于树突状细胞的激活和成熟，从而利于DNA疫苗特异性粘膜免疫反应的诱导。本研究根据课题思路设计了针对小鼠STAT3的核酸干扰序列，分别在不同细胞包括树突状细胞验证有效性，当树突状细胞STAT3被敲低后，可以上调树突状细胞成熟表面分子CD40, CD80, CD86的表达，当使用LPS模拟抗原刺激树突状细胞时可以更加显著增加CD40, CD80, CD86的表达。并构建了包含STAT3 siRNA的靶向防龋DNA疫苗，动物实验验证其有效性，并针对STAT3进行了相关机制研究。发现STAT3可以调控剪切因子的表达，而剪切因子影响树突状细胞的成熟，这可能是STAT3调控树突状细胞成熟并影响免疫反应的机制之一。我们同时对小鼠鼻粘膜相关淋巴组织的RNA进行了深度测序，发现了鼻黏膜特异性差异表达基因。本研究对于其他感染性疾病DNA疫苗的设计有借鉴意义，并对防治龋病提供了一种思路。