杂交竹梢枯病菌毒素化学及其精确作用机制研究

在森林病理学科有关病原菌毒素组分、分子结构及作用机理主要集中在叶部病害,而重大枝干毁灭性病害致病毒素涉及尚少，且毒素的性质、化学成分与结构及致病机理随病原不同而具多样性，特别是通过纯毒素标记，探索纯毒素质膜结合位点和对线粒体膜生物物理特性影响、毒素伤害与寄主代谢相关性，从而更精确诠释毒素的作用机制在本领域尚无人涉及。暗孢节菱孢菌是引起杂交竹梢枯病新病原，其致病机理为空白,本项目将以该病原为对象，在研究毒素的分离纯化、组分和分子结构、基本性质基础上，探索毒素对杂交竹生理代谢影响规律，弄清其作用浓度临界值，比较病菌与毒素对杂交竹伤害的生理学差异；并通过纯毒素免疫化学方法标记分析毒素结合位点和用荧光偏振法、中性红法研究纯毒素对杂交竹嫩枝离体线粒体膜的微粘度、表面电位等生物物理特性的影响，从而更准确诠释该重大枝干病害病原毒素的结合位点。有关研究可填补林木病理学科空白，具有重要的理论和实践意义。

暗孢节菱孢菌是引起四川栽培区杂交竹梢枯病的新病原，其致病机理研究不深入，特别在该菌蛋白毒素方面的研究尚为空白。本课题以该病原为对象，在研究其蛋白毒素诱导因子基础上，对蛋白毒素进行分离纯化、组分和分子结构、基本性质的分析，探索蛋白毒素对杂交竹生理代谢影响规律，弄清其作用浓度临界值，比较病菌与蛋白毒素对杂交竹伤害的生理学差异；并通过毒素免疫化学方法标记分析蛋白毒素结合位点和探索蛋白毒素对杂交竹嫩枝离体线粒体生物物理特性及呼吸作用的影响。获得以下主要研究成果：.1. 诱导方案为：在改良Fries培养基+杂交竹煎汁为基础培养基中，乳糖等量代替葡萄糖；温度25℃，pH7，黑暗条件下，1块菌丝块（5 mm）接种于80 mL培养液振荡培养15 d。.2. 使用Eadam降解法成功地测得N-末端13个氨基酸序列，即H2N-Pro-Pro-Ser-Gln-Val-Gln-Arg-Ala-Pro-Glu-Leu-Thr-Ser，分子量为34.5 kDa，命名为AP-toxin。于NCBI蛋白质数据库进行比对，与Phytophthora sojae的hypothetical protein PHYSODRAFT_563177（gb9[EGZ12397.1]）的476-488位置的氨基酸残基序列100%同源。.3. 蛋白毒素耐温度范围为0-80℃、耐酸碱的范围为pH4-10、耐白炽光却不耐紫外线照射，对蛋白酶K和胰蛋白酶具有较好的耐受性，有一定专化性、介于专化性与非专化性毒素之间。.4. AP-toxin使杂交竹酚代谢和蛋白质代谢初期增强、后期减弱；核酸代谢和糖代谢显著下降，抗病品种变化幅度小于感病品种。AP-toxin对不同杂交竹防御酶活性影响表明，抗病品种POX、SOD、PAL、PPO活性先升高后下降，感病品种降幅较大；几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶活性升高，但感病品种和抗病品种间差异显著。AP-toxin伤害与杂交竹生理代谢的相关性：酚代谢与抗性显著相关；核酸代谢与时间和抗性均显著相关；蛋白质代谢的蛋白酶活性与感病指数相关性不显著外，其余均达到显著水平；可溶性糖含量与时间、抗性、感病指数相关性达到极显著水平；6种防御酶活性与抗性呈显著或极显著正相关，而与感病指数呈负相关。 . 5. AP-toxin的结合位点存在于细胞质膜上。另外，AP-toxin使线粒体膜流动性减弱、表面电位减