脂肪细胞转分化在体构建仿生骨修复眼眶骨缺损的研究

Repair of the orbital bone defects is to improve the appearance, reset the eyeballs positions and maintain the visual function. At present, the material applied clinically to repair the orbital bone defects has its own drawbacks such as infection and rejection because the material can hardly transfer to autogenous bone. Tissue engineered bone can not be applied in clinical due to the problem that the seed cells lack enough blood supply. This program is based on the development of transdifferentiation technology of stem cells and the direct transdifferentiation of the specific cells, combining with the phenomenon that the autologous bone found on the repair material, put forward the research of the direct transdifferentiantion of adipose cells into the bone cells, explore the selection of key transcription factors or DNA fragments using high-throughput gene chip technology, study the efficiency of transdifferentiation and the optimal concentration and the transdifferentiation potency, based on this, tissue engineered bone which is rich in transcription factor is builded, taking advantage of the canine orbital wall bone defects repair model, and employ the methods of the histomorphology and osteogenesis related molecules expression evaluation to study the possibility of the direct transdifferentiation of the adipose cells into osteoblasts to repair bone defects. In this study, the successful development can not only provide a new way of thinking for repairing orbital bone defects, but also provide solutions for the bottleneck problems of the seed cells in bone tissue engineered bone lacking enough blood supply faced at present in clinical applications, and can also promote the study of the differentiation of specific cell directly, which has the important academic value and clinical significance.

修复眼眶骨缺损是为了达到改善外观、复位眼球以维持视功能的目的。但目前修复材料不能自体化，存在排异、感染等弊端。组织工程骨由于存在种子细胞血供营养问题而无法用于临床。本项目基于干细胞转分化技术的发展和特定细胞间直接转分化的实现，结合我们临床病理分析发现的修复材料上自体骨生成的现象，提出开展眼眶脂肪细胞直接转分化成骨细胞的研究，采用高通量基因芯片技术探索筛选关键转录因子或DNA小片段，研究影响转分化效率的因素、最适浓度及其转分化效能，在此基础上构建富含成骨转录因子的组织工程骨，利用犬眶壁骨缺损修复模型，采用组织形态学和成骨相关分子表达等方法评价脂肪细胞直接转分化成骨细胞修复骨缺损的可能性。本研究的成功开展不但为眼眶骨缺损修复提供新思路，更可为当前组织工程骨临床应用中面临的种子细胞血供瓶颈问题提供解决方案，同时能够推进特定细胞间的直接转分化研究，具有重要的学术价值和临床意义。

本课题组通过研究眼眶成体脂肪细胞直接转分化为成骨细胞过程中起关键作用的转录因子及其影响转分化效率的因素 ,分析了探索利用眼眶骨缺损处原位的脂肪细胞直接转分化为成骨细胞的方法解决当前组织工程骨种子细胞的血供问题。经过数次比较脂肪干细胞、成骨细胞的Lnc-RNA和成骨相关micRNA及其信号通路的相关因子；探索hADSCs成骨分化过程中的表达变化的转录因子及其对靶基因Smad5的调控方式, ,miR-424可能是通过影响Smad5的表达来调控hADSCs的成骨分化。抽取人的眶内脂肪细胞，经体外培养，并用3T3-L1细胞进行成脂诱导后，与脂肪细胞和成骨细胞进行对比检测，寻找分化功能变化的LncRNA。高通量基因芯片技术检测脂肪干细胞诱导前后的Lnc RNA的变化，明确在脂肪细胞转分化的过程中变化，并试图从中找到干预脂肪细胞的成骨能力的因子。因此，我们及时把研究方向转向利用新型促成骨材料氧化石墨烯壳聚糖复合间充质干细胞构建仿生骨，进行骨修复研究。. 组织工程骨中应用材料支架能够促进骨缺损修复和组织功能改善,材料支架是否具有适合于生物体内的表面化学性质以及提高材料的促成骨能力是材料支架的关键,因此，我们及时进行了微调整，从两个方面构建新型组织工程仿生骨修复骨缺损：利用新型支架材料氧化石墨烯壳聚糖及其改进型羟基磷灰石氧化石墨烯壳聚糖，利用其良好的理化性质及机械性能及促成骨能力，提高成骨效率，动物实验证实改进的石墨烯壳聚糖具有非常好的成骨性能，为脂肪细胞成骨提供了理想的支架，并可以在支架上负载BMP-2，VEGFA等促成骨及促血管生成的生长因子，有助于提高支架的骨修复能力。；二、利用microRNA对脂肪来源间充质干细胞进行修饰，提高种子细胞的成骨能力。并取得了较好的成骨效果。.虽然羟基磷灰石氧化石墨烯壳聚糖复合间充质干细胞修复眶骨有较好的效果，但氧化石墨烯在体内极少降解，长期存留在体内。因此建议以后的成骨性能的提高是从改善微环境，从而提高仿生骨的成骨能力来修复骨缺损。支架降解时释放因子改善微环境来促进成骨可能是以后可用于临床的研究方向。.研究进程基本在原计划方案的基础上针对现有组织工程骨体内回植时存在的血供瓶颈问题,围绕脂肪细胞转化为具备成骨能力的细胞并进行骨缺损的修复进行了深入的多层面的探索，研究进度大致与设计的节点一致，研究目标基本完成。完成论文4篇，正在撰写投稿2篇