复合3-D仿生基质骨的构建及其修复骨缺损的研究

The repair of bone defects is still a medical challenge. Tissue engineering and genetic therapy is thought to be an ideal approach to repair bone defects. However, some issues are still remaining in stem cells differentiation, scaffold construction and efficiency of gene transduction, etc. We need to investigate further how to construct an ideal gene supplemented tissue engineering bone. The proposed research will focus on the integration of biomaterials, multilayered gene release system, multilayered nanoparticles , BMSCs and ENSs, and will develop and characterize novel nanomedicine and bioactive composite 3-D biomimetric scaffolds. This nanocomposite design will include PAMA multilayered gene release system, plasmids encoding BMP 2 and 7 ( pBMP-2/7) as gene medicine for bone tissue engineering, electrospun nanofibours of biopolymers into 3-D biomimetic scaffolds (ENSs) as bone graft for stem cells and nanomedicine seeding. The proposed research is expected to develop new methods, technology and materials that will diminish the risks of current transplant therapy.

骨缺损的修复是尚未解决的临床难题，应用组织工程和基因工程构建组织工程人工骨被认为是解决该难题的理想途径, 如何构建理想的载目的基因组织工程人工骨需要更深入研究。为此，我们提出设想，目的基因质粒、多聚物（PAMA）纳米基因载体、BMSCs和电纺纳米支架（ENSs）有机组合，构建新型复合3-D仿生基质骨。为了这个设想我们将采用如下方法: 1）制备PAMA多层基因释放系统用来载BMP-2/7基因，2) 将胶原、丝素蛋白和壳聚糖用于制作电纺纳米纤维，将电纺纳米纤维装配成具有3-D结构支架，承载BMSCs和PAMA多层基因释放系统, 构建成一种新型的复合3-D仿生基质骨。3）通过骨缺损动物模型实验，检验这种新型复合3-D仿生基质骨修复骨缺损、促进骨再生作用。这项研究有望开发出新的方法、技术和材料，以减少目前骨移植治疗的风险。

目的：将骨形态蛋白-7（BMP-7）、明胶微球载体和丝素电纺纳米材料有机结合，构建新型复合3-D仿生基质骨支架材料，通过细胞及动物实验检测该支架材料修复骨缺损、促进骨再生作用。.方法: 将丝素蛋白（SF）及壳聚糖（CS）以质量比1∶1溶于三氟乙酸和二氯甲烷混合溶剂中，采用静电纺丝技术制备SF/ CS电纺支架，用10倍模拟体液仿生矿化SF/CS电纺支架制备仿生矿化丝素电纺支架（SF/CS/Ca-P组），制备载BMP-7明胶微球，并通过明胶-甲基丙烯酰胺（GelMA）水凝胶将其载至仿生支架制备载BMP-7的丝素电纺复合支架（SF/CS/Ca-P/BMP-7组）。通过扫描电子显微镜( SEM) 、红外光谱( FTIＲ) 、力学性能检测等对支架的结构性能进行表征。药物释放试验检测BMP-7的体外释放特征，CCK-8和DAPI染色检测支架的生物相容性，碱性磷酸酶活性试验和RT-PCR检测支架的体外骨再生能力。构建大鼠颅骨缺损模型，CT扫描、HE及Masson染色评估支架的体内骨再生情况。.结果 SEM和FTIR显示SF/CS支架具有均一的纤维直径且构象稳定，仿生矿化后的丝素电纺支架表面形成明显的羟基磷灰石矿化层，明胶微球通过GelMA水凝胶均匀分布于支架。吸水率及力学性能证实仿生矿化后的丝素电纺支架物理性能较SF/CS支架显著提高。药物缓释实验结果显示BMP-7在短暂的突释后呈局部缓慢释放效果。CCK-8及DAPI实验结果显示支架均具有良好的生物相容性，ALP及RT-PCR检测结果显示与SF/CS组及SF/CS/Ca-P组支架相比，SF/CS/Ca-P/BMP-7组对骨髓间充质干细胞的体外成骨分化能力具有显著促进作用。此外，动物实验结果表明SF/CS/Ca-P/BMP-7组支架的植入更有利于促进大鼠骨缺损的再生修复。.结论 载BMP-7的丝素电纺复合支架能有效促进骨再生，有望为进一步探索发展组织工程化骨移植材料的临床应用做出贡献。