沙门氏菌鞭毛蛋白作为疟疾偶联疫苗载体的研究

Pfs25蛋白是疟疾阻断疫苗的一个主要候选抗原，通过化学偶联可提升Pfs25的免疫原性。细菌鞭毛蛋白是Toll样受体5（TLR5）的配体，鞭毛蛋白与TLR5的结合可激活这一受体并引发系列免疫应答。我们拟在毕氏酵母系统中表达Pfs25，在大肠杆菌系统中表达鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC，用化学偶联的方法构建Pfs25-FliC偶联分子，同时构建Pfs25与绿脓杆菌重组去毒外毒素rEPA以及与自身相偶联的两种Pfs25偶联分子。免疫小鼠，检测和比较抗Pfs25的特异性抗体水平和抗体亚型、与Th1和Th2相关的细胞因子分泌水平、分泌特异性抗体的浆细胞数量、免疫血清遏制疟原虫在按蚊体内卵囊生成的能力，并从体外和体内两个角度来考察三种不同的Pfs25偶联蛋白对抗原递呈细胞的作用。通过这样的实验来评估沙门氏菌鞭毛蛋白作为偶联疫苗载体的价值，分析偶联的Pfs25提高抗原免疫原性的内在免疫机制。

一个疫苗要能有效激发免疫应答需有两个信号，作为第一信号的抗原和作为第二信号的抗原递呈细胞刺激剂。沙门氏菌鞭毛蛋白是Toll受体5（TLR5）的配体，而TLR5分布在很多免疫细胞上，包括作为抗原递呈细胞的树突状细胞，因此沙门氏菌鞭毛蛋白是抗原递呈细胞的刺激剂，很多研究表明沙门氏菌鞭毛蛋白是一个有效的疫苗佐剂。但是以沙门氏菌鞭毛蛋白为佐剂的研究，多数是将抗原与沙门氏菌鞭毛蛋白融合表达，或与沙门氏菌鞭毛蛋白单纯混合，尚未有专门的研究来探讨沙门氏菌鞭毛蛋白作为偶联疫苗载体时的佐剂效果。在本项目中，我们开展了沙门氏菌鞭毛蛋白作为偶联载体的佐剂效果研究，取得了如下的实验结果。构建了含鼠伤寒沙门氏菌I相鞭毛蛋白基因的大肠杆菌表达质粒，在大肠杆菌中表达并纯化了重组沙门氏菌鞭毛蛋白（rFliC），通过化学连接剂Sulfo-EMCS使rFliC被马来酰亚胺基团所修饰（rFliC-M）。合成恶性疟原虫输出蛋白1的一个B细胞表位肽EXP153，与rFliC-M进行反应形成偶联产物rFliC-EXP153。生物活性检测显示，无论是马来酰亚胺基团修饰还是与EXP153偶联，rFliC没有丧失TLR5配体的活性。用rFliC-EXP153通过皮下注射免疫BALB/c小鼠，在没有任何其他佐剂的情况下，在小鼠中激发出高效价的肽特异性抗体，并且所激发的抗体识别疟原虫的天然抗原，而未偶联的EXP153肽无法在小鼠中激发出能检测到的肽特异性抗体应答。用rFliC-EXP153通过鼻粘膜免疫BALB/c小鼠，同样在没有任何其他佐剂的情况下，不仅在小鼠血清中检测到高效价的肽特异性IgG抗体，并且在小鼠的肺灌洗液和鼻腔冲洗液，甚至在小肠和阴道冲洗液中检测到肽特异性IgA抗体。上述实验结果表明，沙门氏菌鞭毛蛋白是一个很有潜力的肽偶联疫苗载体蛋白，并且在作为偶联载体蛋白时具有粘膜佐剂活性。此外，我们还开展了恶性疟原虫Pfs25与沙门氏菌鞭毛蛋白的融合表达研究，构建的融合基因在不同的大肠杆菌表达系统中进行了表达，用纯化的Pfs25FliC融合抗原进行了小鼠免疫试验。结果表明：与沙门氏菌鞭毛蛋白的融合使Pfs25以可溶蛋白的形式表达在大肠杆菌胞质中，并且有很高的表达水平，Pfs25FliC融合抗原在没有其他佐剂的情况下，在小鼠中激发出高效价的特异性抗体应答。