VEGF-A调控整合素双向信号转导在抗新生血管治疗后GA发生中的作用机制研究

Geographic atrophy (GA) is the leading cause of vision loss in age-related macular degeneration (AMD) patients. Recently, large-sample clinical trials have revealed the increased incidence of GA after anti-VEGF therapy, but the mechanisms remain elusive. Our previous study found that the expression of VEGF and integrin both increased in RPE cells during the process of choroidal neovascularization, as it causes the inhibited RPE apoptosis. Therefore, we propose the following hypothesis: The interplay between VEGF and Integrin signal can be suppressed by VEGF antibody, leading to RPE apoptosis. Thus long-term use of VEGF antibody will promote the occurrence of GA. Our study will simulate the RPE "anoikis" status in AMD in vitro and in vivo, multiple treated with VEGF antibody. Firstly, PCR array and protein analysis floating chip will be used to screening and determine the key subunit of integrin. Using flow cytometry, RPE phagocytosis assay, PI stain，transmission electron microscope, and immuno-electron microscope to verify the change of integrin expression/activity, and to investigate related RPE function and cell survival. Secondly, we will use biological peptides to interference integrin beta subunit to reveal the key molecular of interplay action between VEGF and Integrin bi-directional signal transduction. It is very hopefully that this project can reveal a novel pathogenesis of GA after anti-VEGF treatment, and to explore and suggested new intervention targets, and to provide new evidence for the clinical treatment of AMD.

地图样萎缩（GA）是导致老年黄斑变性（AMD）患者视力不可逆损伤的重要原因，近期大规模临床试验发现抗VEGF治疗后GA发病率增高，其机制不明。我们前期研究发现RPE细胞的VEGF和整合素升高具有协同作用，推测VEGF抗体可能阻断了病理状态下VEGF对整合素双向信号转导通路的调控，加重RPE细胞变性死亡导致GA发生。本研究将通过体内外研究，首先通过PCR Array和悬浮抗体芯片筛选，明确与VEGF相互作用的关键整合素亚基；应用流式细胞仪、RPE细胞吞噬功能定量研究及透射电镜、免疫电镜等方法，结合OCT、FA活体观察，阐明VEGF及其抗体对整合素及其介导RPE细胞功能与存活的影响；通过生物多肽干扰整合素β亚基功能，寻找VEGF对整合素双向信号转导的调控位点，以揭示抗新生血管治疗后GA发生发展的新机制、获得新的干预位点，为AMD的临床诊治提供新的思路。

抗VEGF-A是目前湿性 AMD的一线治疗方法。但是，长期观察结果发现患者持续接受抗 VEGF-A 治疗 5 年后 71.9% 患者视力再次下降到治疗前水平或更差。本课题组前期研究发现高浓度VEGF-A抗体可导致光感受器细胞和色素上皮细胞（RPE） 凋亡，可能通过上调 RPE 细胞的 Integrinα5β1 表达水平而发挥相应效应。本课题以这些发现为基础，进一步探索长期抗VEGF-A治疗中的视网膜损伤的分子机制及VEGF-A与整合素之间的关系。我们首先成功构建高表达sVEGFR1（sFLT-1）的腺相关病毒，证实长时间的VEGF剥夺可引起视网膜细胞损伤，主要是神经节细胞死亡及RPE损伤，通过RNA-seq探索可能的分子机制，发现多条凋亡通路，免疫相关通路和整合素家族被富集，TGFβ1，CTGF等纤维化相关基因明显上调。进一步在OIR模型中通过整合素α5β1抑制剂ATN-161的干预研究证实了与VEGF-A共同作用的主要是整合素α5亚基；在体外进一步明确了整合素α5亚基是通过激活FAK/AKT和FAK/ERK通路从而促进VEGF-A诱导的新生血管生成。同时，我们还发现CNV模型中，CNV、RPE损伤的过程中存在巨噬细胞/小胶质细胞和muller细胞激活，提示炎症可能参与了抗VEGF治疗后视网膜损伤，故我们对巨噬细胞在CNV中的作用进行了初步探究。研究发现小鼠CNV 形成早期，巨噬细胞发生M2型极化。通过体外巨噬细胞极化干预模型，发现miR-155通过C/EBPβ调控巨噬细胞M2 型极化，并在小鼠CNV模型中得到验证。最后，miR-155mimic干预CNV后，CNV 荧光的渗漏显著减少，CNV 的高度及面积明显变小，证实miR-155 mimic 能有效抑制 CNV 的发展。研究的完成初步阐明长期VEGF-A剥夺引起视网膜损伤的分子机制，不仅为今后抗VEGF治疗过程提供更多的理论依据，也为AMD的干预靶点和治疗策略提供新的思路。