狂犬病病毒弱毒株对不同日龄乳鼠致病性差异机理的研究

In general the attenuated strains of Rabies virus(RV) do not cause the death of adult animals, however it may do in newborn animals. Our experiments find that the attenuated strain, SRV9, can result in the death of the suckling mouse younger than 13 days old, but not in those older than 18 days. And a proportion of animals aged between 14 and 17 days old died too, those who survived had got an adverse effect in their growth and development in the subsequent 2 months, characterized by a slow increase in body weight, being significantly smaller than control. The preliminary experimental results show that the different expression of some proteins in the brain of suckling mouse may play a key regulatory role， for example CRMP-4,IFN,Ras pathway. Therefore, this project intends to have a detailed proteomic analysis to the neonatal rats before and after lethal-day and the neonatal rats survived; analyse the proteins expressed differentially in term of bioinformatics annotation and pathway; screen important target proteins; and functionally verify the target proteins through gene silencing, over expression, immunological coprecipitation and protein-protein interactions. Thereby, we can determine target proteins which play a key role in the regulation of the phenomenon above and their possible regulatory pathways, and reveal that the molecular mechanism of pathogenic differences of RV attenuated strain on different day old suckling mouse, providing strong data support for pathogenic mechanism in RV.

狂犬病病毒（RV）弱毒株一般在成年动物不致病，而在初生动物常致病死亡。试验发现，RV弱毒株SRV9即使是致乳鼠死亡，也是在13日龄以下，18日龄以上则不发病；而14～17日龄乳鼠则是部分死亡，且存活的乳鼠在其后的2个月中，生长受到明显抑制。为何SRV9对仅相差数天的乳鼠致病性差异显著？以此为切入点，预实验表明，致死日龄前后乳鼠脑内一些蛋白的差异表达及其信号通路的改变发挥了关键作用,例如CRMP-4蛋白、干扰素和Ras通路。因此，本项目拟对致死日龄前后及攻毒存活的乳鼠，进行细致的蛋白质组学分析；对差异表达蛋白进行生物信息学的功能注释和Pathway分析，筛选出有意义的靶蛋白（CRMP-4等）；进而对靶蛋白及其信号通路上的关键蛋白，进行免疫印迹、基因沉默和过表达等蛋白互作的功能验证。从而确定SRV9致死乳鼠中起关键调控作用的靶蛋白及其调控路径，揭示RV弱毒株对不同日龄乳鼠致病性差异的分子机制。

狂犬病病毒（Rabies Virus）弱毒株一般在成年动物不致病，但在初生动物可致死亡。试验发现，RV弱毒株SRV9感染乳鼠，13日龄以下死亡、18日龄以上不发病、 14～17日龄乳鼠则部分死亡。SRV9对生长相差仅数天的乳鼠致病性差异为何如此界限鲜明？本研究以此为切入点，选择致死日龄前后、攻毒发病及其对照组乳鼠，进行定量蛋白质组学(iTRAQ)分析，结果表明SRV9感染乳鼠后诱导了类似单纯疱疹病毒、人类嗜T细胞病毒以及Toll样受体和NF-kB的信号通路。.本研究组进一步深入对差异表达蛋白进行生物信息学的功能注释和Pathway分析，确定潜在意义的靶蛋白（如CIAPIN1、NF-kB 等）；对靶蛋白及其信号通路上的关键蛋白，进行免疫印迹、基因沉默和过表达、免疫共沉淀等蛋白互作的功能验证，结果表明狂犬病病毒弱毒株SRV9感染乳鼠诱导了机体全面的免疫应答，其中Toll样受体和NF-kB的信号通路的应答和调控最为明显。此外，SRV9感染乳鼠所诱导的一些蛋白的变化及其形成的通路变化，与单纯疱疹病毒、人类嗜T细胞病毒非常相似。.本研究另外一个值得深入的发现是SRV9感染乳鼠与弓形虫引起的感染具有很大的相似性，初步试验表明他们可以交叉保护。我们推测SRV9感染乳鼠的模式与弓形虫的感染都强有力的诱导了特异性的细胞免疫应答和天然免疫应答，进而可以抑制新进病原的侵入和感染。同时，SRV9感染乳鼠的模式表明免疫系统发育完善的实验动物特异性的细胞免疫应答和天然免疫应答，可期在感染早期启动，进而抑制SRV9的致病，在随后的特异性体液免疫应答产生之后，即中和抗体产生之后，可清除病毒；而免疫系统发育仍不完善的低日龄乳鼠，不能在早期产生特异性的细胞免疫应答和天然免疫应答，进而不能抑制病毒进一步的损伤，在特异性体液免疫应答（也可能本身就不完善）前，就发病死亡。上述结果为确定SRV9致乳鼠死亡中起关键调控作用的靶蛋白及其调控通路，揭示RV弱毒株对乳鼠致病性的分子机制提供了有力证据。