CCP2在肝癌发病中的作用及其分子机制研究

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common and lethal malignancies in China and worldwide. The molecular basis for this clinical heterogeneity remains largely unknown, leading to no effective therapy for liver cancer. Post-translational modifications of proteins have important roles in their functions and human tumorigenesis. Glutamylation modification have become the forefront and hotspot in biology research, and play important roles in biological process. So far, however, little is known about the function and mechanism of glutamylation modification in cancer research. Our previous study found that expression of CCP2 was down-regulated in tumor tissues than in peri-tumor tissues. CCP2-/- mice tended to be induced to form liver tumors compared with wide type mice. Furthermore, CCP2 depletion promotes the capacity of cancer cell proliferation and onco-sphere formation. We identified several candidate substrates with enzyme inactivated CCP2. This project will further investigate the functions of CCP2 mediated glutamylation modification in human liver tumorigenesis. We will identify specific substrate of CCP2 and signaling pathway mediated by glutamylation modification. Then, we will examine the relationship between glutamylation modification mediated by CCP2 and prognosis of HCC patients. Taken together, this project will provide new insights into the function and molecular mechanism for glutamylation modification in liver tumorigenesis and help to reveal more effective treatment targets for liver cancer.

我国已经成为肝癌发病率最高的国家之一，肝病已成为我们国家的“国病”，由于目前对肝癌的发病机理尚未阐明，故缺乏有效的治疗手段，因此，攻克肝癌是我国肿瘤研究的首选课题。近年来发现，蛋白质谷氨酸化修饰参与多种生命过程的调节，谷氨酸化修饰与疾病的关系也成为当今研究的热点，而在肝癌中的功能还未见报道。我们初步研究发现，羧肽酶CCP2在人类肝癌组织中低表达，CCP2基因敲除小鼠极易诱发肝癌，表明CCP2介导的谷氨酸化修饰参与肝癌的发生发展过程。还发现，CCP2沉默的肿瘤细胞增殖及成球能力显著增强。我们表达了酶活性失活的CCP2，鉴定了CCP2的数个候选底物。在此基础上，本课题将深入研究CCP2介导的谷氨酸化修饰在肝癌发病中的作用，明确谷氨酸化修饰与肝癌发生的关系。鉴定出CCP2致癌的作用底物以及谷氨酸化修饰介导的信号通路，以期揭示谷氨酸化修饰调节肝癌发病的分子机制，为肝癌的诊断和治疗提供新靶点。

我们采用荧光定量PCR及免疫组化染色分析了196份肝癌样本，发现CCP2在肝癌组织中呈现低表达。我们制备了CCP2基因敲除小鼠，用肝癌的化学诱导剂二乙基亚硝胺（DEN）诱导，CCP2基因缺失小鼠极易诱发肝癌，表明CCP2参与肝癌的发生发展过程。我们还在肝癌细胞中敲低CCP2的表达，CCP2沉默的肿瘤细胞增殖及成球能力显著增强。基因芯片显示：CCP2基因的表达程度与肝癌负相关。免疫组化显示：CCP2的表达程度与肝癌负相关。PCR和Western显示：CCP2的表达程度与肝癌负相关。肝功能显示：CCP2 KO小鼠早期出现肝损伤。HE病理显示：CCP2 KO小鼠早期出现炎症细胞浸润。流式显示：CCP2 KO小鼠肝脾T、B细胞差异不显著，出现肝巨噬细胞浸润。.肝癌干细胞的分子机制研究具有十分重要的理论价值和临床应用前景。探讨肝癌的发病和复发机制成了肝癌治疗的当务之急，研究中我们通过鉴定出CCP2靶蛋白底物的多聚谷氨酸化酶（TTLL酶），制备CCP、TTLL等基因敲除小鼠，分析鉴定CCP2的作用底物，探究CCP2对肝癌干细胞、固有免疫细胞自我更新的调控作用，探索研究揭示CCP2谷氨酸化修饰调节肝癌发病的分子机制(Liu, Ye et al. 2017)。.我们发现CCP2在CHILP中高表达，CCP2缺失使得ILC3数量增加。机制上，我们发现IL-7Ralpha能够被TTLL4和TTLL13进行谷氨酸化修饰而被CCP2去谷氨酸化修饰。IL-7Ralpha谷氨酸化修饰能够促进STAT5活化，进而起始Sall3表达，最终Sall3调控ILC3发育分化。此外，将IL-7R alpha谷氨酸化位点突变或者敲除Ttll4或Ttll13都能抑制ILC3发育。因此，我们揭示了IL-7R alpha谷氨酸化修饰对ILC3发育分化的调控作用。其成果发表在Nature communications上。.我们还深入研究了CCP蛋白介导的谷氨酸化修饰在疾病发病中的作用，明确谷氨酸化修饰与疾病发生的关系，以期揭示谷氨酸化修饰调节疾病发病的分子机制。我们鉴定了出另一种多聚谷氨酸化修饰的作用底物转录因子Klf4，分析表明CCP2在早期小鼠细胞及胚胎发育过程中发挥调控作用。