骨髓间充质干细胞与神经干细胞序贯移植修复脊髓损伤的作用及机制研究

Spinal cord injury (SCI) therapy is intractable, nervertheless stem cells (SCs) transplantation shows good prospects.Neural stem cells (NSCs) can differentiate into various types of neural cells and are very promising replacement therapy cells, but the microenvironment of injured spinal cord seriously impact on the survival, colonization and differentiation of NSCs.Mesenchymal stem cells (MSCs) can regulate the immune response of SCI and paracrine growth factors, improve microenvironment. Our previous study has demonstrated that MSCs were benifited to NSCs fate，however BMPs which is a kind of early spinal cord injury factors in vivo will obstruct the effect. We speculate that the first MSCs transplantation and sequential NSCs transplantation, have a good cooperative therapeutic effect on SCI! The experiments will observe NSCs fate when BMPs is added into co-culture system with bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs) and NSCs ;Meanwhile we will detect spinal cord levels of BMPs and cytokines,and observe blood vessel formation, syringomyelia, glial scar size, NSCs fate and the spinal cord function after establishing the rat model of respectively subarachnoid or artery sequential transplantation NSCs to treat SCI in vivo;We also explore sequential transplantation effectiveness and way of perfusion，and elucidate the mechanism. Those may provide several new methods for SCI therapy of SCs.

脊髓损伤（SCI）治疗棘手，干细胞（SCs）移植为其展现了良好的前景。神经干细胞（NSCs）可直接分化为各类神经细胞，是极有前途的替代治疗细胞，但脊髓损伤的微环境严重影响了NSCs转归。间充质干细胞（MSCs）可调节SCI的免疫炎性反应并旁分泌细胞生长因子，改善微环境。我们前期研究证实MSCs有利于共同培养NSCs的转归，但在体内早期脊髓损伤因子BMPs可能影响NSCs的转归，据此我们推测先行MSCs移植，再行NSCs序贯移植，才能有助于协同效应的最大发挥！本实验将在体外观察BMPs对 NSCs与骨髓间充质干细胞（BMSCs）共同培养时转归的影响；建立脊髓损伤大鼠模型，分别经蛛网膜下腔和主动脉序贯移植，检测脊髓BMPs及细胞因子水平，观察血管形成、脊髓空洞、胶质疤痕的大小，NSCs转归及脊髓功能恢复情况；探索序贯移植的有效性和途径并阐明机制。这可能为SCs治疗SCI提供新的方法和途径。

脊髓损伤后局部恶劣的微环境造成了残存神经细胞进一步损伤，限制和阻碍了神经的再生和重建。我们研究发现在脊髓损伤后局部BMPs及其下游蛋白p-Smad 1/5/8表达明显增加，说明脊髓损伤后BMP/Smad信号通路的激活。细胞水平研究证实当BMP4作用于NSCs能够导致其向少突胶质细胞和神经元比例减少，而作为瘢痕主要组成部分的星形胶质细胞比例增多，在对其机制研究时发现BMP主要通过磷酸化Smad 1/5/8，进而调控Id2/Olig平衡，促进NSCs向星形胶质细胞分化，提示损伤后BMPs分泌的增加是导致内源性神经干细胞无效分化，胶质瘢痕形成的主要原因。同时，我们还研究了继发性炎症反应对脊髓损伤的影响，结果表明损伤后局部促炎因子的表达增加，抗炎因子分泌的不足是导致残存神经细胞进一步凋亡的主要原因。在这些因子中BNDF很有可能在NK细胞的激活中发挥了重要作用，为后续研究损伤后炎症反应的激活机制提供了重要的依据。明确了损伤后微环境主要的变化后，我们利用体外共培养和体内BMSC条件培养基灌注，结果证实了BMSCs能够通过抑制Smad 1/5/8的磷酸化从而减少瘢痕的形成，促进轴突的再生。还能够抑制损伤早期的炎症因子，促进抗炎因子的分泌，进而减少继发性过的炎症反应对脊髓残存组织的进一步损伤。这对BMSCs应用于临床移植治疗脊髓损伤提供了重要的理论依据和应用价值。此外，我们还研究了在BMSCs所分泌的各种细胞因子中，到底是哪个一个或几个细胞因子发挥着重要作用。结果表明，HGF能够发挥和BMSCs一样的生物学效应，包括，通过抑制Smad 1/5/8磷酸化调控Id/Olig 平衡，进而促进NSCs向少突胶质细胞分化；减少早期促炎因子的分泌和增加抗炎因子早期的表达，保护残存神经细胞。当采用c-met抑制剂后，BMSCs的主要生物学效应均能够被明显的抑制。以上结果均提示HGF是BMSCs所分泌的细胞因子中，发挥主要作用的细胞因子。