Shootin1基因修饰骨髓间充质干细胞移植对脊髓损伤的修复作用及机制研究

在神经元发育过程中,轴突和树突分化和形成是神经元极化建立的标志,也是建立神经信号转导的基础。研究发现Shootin1基因是神经元极化和轴突生长的关键调节基因。迄今Shootin1基因及其蛋白对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells ，MSCs)的作用尚未见相关报道。我们创新性设想在基因水平上调骨髓间充质干细胞中Shootin1蛋白的表达，可能能促进MSCs向神经元的分化，同时又促进损伤轴突的再生。本研究构建携带Shootin1基因的腺病毒表达载体并转染MSCs，体外定向诱导分化后植入大鼠脊髓损伤的局部，对植入的MSCs进行形态学示踪观察，检测神经元分化和轴突生长情况，并对大鼠的运动功能进行评价和分析，探讨Shootin1基因转染MSCs移植修复脊髓损伤的效果及其作用机制。通过本项研究，有望为脊髓损伤的细胞移植治疗开辟一种全新有效的治疗方法。

本课题探讨过表达Shootin1的BMSC- Shootin1对大鼠脊髓损伤模型的神经再生能力，尝试结合新型神经极化相关蛋白Shootin1与BMSC的优势达到提高脊髓损伤后运动功能恢复的效果，同时突破BMSC在脊髓损伤治疗中存在的存活率低和分化效率弱等问题，优化治疗脊髓损伤的修复方法，为BMSC运用到临床治疗提供一个有潜在价值的新方法和新理论依据。首先通过腺病毒转染建立过表达Shootin1的BMSC，；在体外通过神经诱导分化，检测了Shootin1转染的BMSC神经分化上是否较BMSC诱导分化更具有优势，通过免疫荧光检测神经巢蛋白Nestin与神经元特异性核蛋白NeuN的表达情况；运用改良的Allen 撞击装置制备脊髓撞击损伤模型，并选择在脊髓损伤后半小时内进行原位注射进行细胞移植治疗。SCI造模后在蛛网膜下腔注射移植Shootin1-BMSC和BMSC进行脊髓损伤后修复治疗。在治疗后1个月处死SCI动物取脊髓样本进行冰冻切片检测神经标记。研究发现经过腺病毒转染48小时，免疫荧光IF与Western Blot检测BMSCs内已成功表达Shootin1蛋白；体外神经诱导分化7天后，三组细胞形态上均发生了变化，通过对神经前体细胞特异性标记Nestin以及神经元特异性核蛋白NeuN的IF检测发现，Shootin1-BMSC和BMSC两组Nestin与NeuN的表达差异不明显；脊髓撞击损伤大鼠体内实验发现，细胞移植组与PBS对照组相比，运动功能恢复上检测到明显的变化，且Shootin1-BMSC移植组BBB评分最高。移植Shootin1-BMSC组和BMSC组均有神经巢蛋白Nestin,神经元特异性核蛋白NeuN, 神经胶质纤维酸性蛋白GFAP, 微管相关蛋白-2 MAP-2, 胆碱乙酰基转移酶ChAT，突触蛋白SYN表达的升高，同时行为学运动功能恢复也有一定提高，神经再生能力增强。据此，本实验再次认证了BMSCs细胞移植治疗脊髓损伤的显著性效果；同时揭示了Shootin1蛋白对大鼠脊髓损伤后的神经再生及神经功能性恢复上起到一定作用，但其作用对于BMSCs直接移植组来说修复差异仍不太明显，优化BMSC对脊髓损伤的治疗仍需进一步研究。