基于HIEs模型的HuNoV内吞机制及涩肠止泻中药的干预作用研究

Human noroviruses (HuNoVs) are the most common cause of epidemic and sporadic of acute gastroenteritis worldwide. However, the mechanisms how HuNoVs infect the intestinal tract and cause disease are not well elucidated. Researchers have recently discovered that human noroviruses infect B cells in vitro and hypothesised that NoVs transcytosed across the intestinal epithelial barrier via M cells. Another achievement reported successful cultivation of multiple HuNoV strains in enterocytes of Lgr5+ stem cell-derived, nontransformed human intestinal enteroid monolayer cultures. It was viewed as the key to unlock the 48 year mystery of the HuNoV infection mechanism. This project focuses on the construction contains M cell type HIEs monolayer culture system using the Transwell system in domestic for the first time, and applied it to establish GII.4-Sydney strain HuNoV infection model in vitro, which will provide a new platform for research on both pathological mechanism and drug for HuNoV. Endocytosis experiment will be designed using the newly established in vitro HUNoV infection model, Immunofluorescence analysis and RT-qPCR technology. And the role of M cell trafficking in HuNoV infection will be clarified. Based on our previous work, evaluation of the anti HuNoV effect of Galla chinensis and pomegranate will be performed in the gut tissue for the first time. This project will reveal the mechanism and the profound scientific connotation of traditional Chinese medicine "Sechang Zhixie".

人诺如病毒（HuNoV）是全球非菌性急性胃肠炎暴发流行和散发病例的主要致病原，至今感染机制不明。学者最新研究发现HuNoV能感染小肠黏膜下免疫B细胞，并提出相应的“M细胞转胞吞作用感染机制”假说；另外在Lgr5+干细胞来源的成人小肠类器官（HIEs）中成功培养HuNoV，为解开感染机制的“48年之谜”找到了钥匙。本项目致力于使用Transwell系统在国内首次构建包含M细胞类型的HIEs单层培养体系，并应用于建立GII.4-Sydney株HuNoV体外培养模型，这将为开展HuNoV病理机制和药物研究提供全新的平台。通过运用该模型，综合采用免疫荧光分析和RT-qPCR等技术首创性开展M细胞介导的胞吞转运作用机制研究，从而阐明并验证HuNoV感染机制假说。同时在前期工作基础上，首次在肠道类组织环境中进一步评价中药五倍子和石榴皮的抗HuNoV作用，深刻揭示中药“涩肠止泻”的作用机制和科学内涵。

诺如病毒是病毒性胃肠炎爆发的主要病原体，长期以来由于缺乏有效的体外细胞培养和体内小动物感染模型，HuNoV的感染机制和抗病毒药物研究进展缓慢。本课题致力于使用Transwell系统构建包含M细胞类型的HIEs单层培养体系，并应用于建立GII.4-Sydney株HuNoV体外培养模型，从而开展HuNoV的感染机制和中药抗病毒机制研究。在国内较早建立 HIEs 单层培养体系，并运用于建立GII.4-Sydney 株 HuNoV 体外培养模型，为深入开展 HuNoV 的病理机制和药物开发研究提供全新的平台。研究发现HuNoV在HIEs中的病毒复制水平不高，用于HuNoV体外培养尚存在一定的不确定性。深入研究了轮状病毒RVs与HBGAs的相互作用在RVs的宿主适应特性及病毒进化和流行规律，为制定RVs疫苗的新策略以及寻找开发新的抗RVs药物具有深远意义。在国内较早提出RV VP8*-HBGAs受体结合/阻断作用模型可作为一种新型有效的体外筛选抗RV药物模型。研究证实石榴皮水提液能明显阻断RV VP8*结合HBGAs（A/B/O）受体，在细胞水平证实具有较好的抗病毒效果。阻断受体结合作用可能是石榴皮等中药具有“涩肠止泻”特性的重要机制。成功构建了九种不同 NoVs 毒株的重组表达质粒并利用原核表达系统表达了九株 GⅡ/GI NoVs P 颗粒（GⅡ.2、GⅡ.4/VA387、GⅡ.6、GⅡ.12、GⅡ.17、GⅡ.21、GI.2、GI.3 和 GI.9），通过对GⅡ/GⅠ.NoVs 基因型的抗原相关性特征进行分析，首次证实了国外学者关于NoVs 免疫分型的理论，对 NoVs 的疫苗研制策略具有重大的指导意义。本项目发表SCI论文9篇，中文核心期刊5篇，申请专利2项，培养博士研究生2名，硕士研究生1名。