恶性黑素瘤增殖、侵袭、转移及衰老过程中BRAF V600E突变的作用的研究

BRAF V600E突变被认为是恶性黑素瘤发生的关键起始因素，然而我们的最新研究发现恶性黑素瘤组织中除BRAF V600E突变型细胞外，尚存在大量BRAF野生型细胞，而在转移灶中突变型细胞明显增多，由此对BRAF V600E的决定性起始作用提出了质疑。为重新定位在恶性黑素瘤细胞增殖、侵袭、转移及衰老过程中BRAF V600E突变的具体作用，本课题应用单细胞克隆技术从原代培养的恶性黑素瘤中获取BRAF V600E突变型和BRAF野生型细胞，通过xCELLigence细胞检测技术、裸鼠体内成瘤实验及Western杂交技术比较两种细胞增殖、侵袭、转移及衰老的特性，以阐明BRAF V600E突变在恶性黑素瘤发生发展中的作用，丰富对恶性黑素瘤发病机制的理解，为进一步寻找调节BRAF V600E突变型与野生型细胞异常增殖、侵袭及转移的始动基因，实现恶性黑素瘤的多靶位分子治疗奠定基础。

本研究拟通过分离人恶性黑素瘤组织中BRAF V600E突变型和BRAF野生型肿瘤细胞的单细胞克隆，并比较上述两种细胞在增殖、侵袭、凋亡、衰老及成瘤等方面生物学性能的差异，来探讨BRAF V600E突变在恶性黑素瘤发生发展中的作用。然而实际工作中，中国人的恶性黑素瘤以肢端黑素瘤为主，大多为BRAF野生型，试图在同一肿瘤组织中同时分离到BRAF突变型及野生型黑素瘤细胞的几率极低，我们多次尝试均以失败告终。恶性黑素瘤的发展过程中，MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路至关重要，且多处于持续活化的失调状态。BRAF位于RAS-RAF-MEK-ERK1/2信号通路，是MAPK通路中最受关注的一个。针对BRAF V600E的分子靶向治疗一直是恶性黑素瘤研究的热点，BRAF V600E抑制剂Vemurafenib已获得FDA批准并投入临床应用，虽可延长患者的生存期，但相当一部分患者5-7个月后仍产生耐药，且该药物对BRAF野生型的恶性黑素瘤患者无效。因此，本研究试图寻找一个对BRAF突变型和野生型恶性黑素瘤均适用的新靶点。. CDKL1（细胞周期素依赖性激酶样激酶1）是CDC2（细胞分裂控制蛋白2）-相关丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族的成员之一。CDKL 激酶家族被认为是CDK（细胞周期蛋白依赖性激酶）家族的一个独立分支，与信号转导酶MAPK相似。 CDKL1 含有保守的MAPK双磷酸化模体，可能参与信号转导。有研究表明，CDKL1在乳腺癌和胃癌中高表达，且抑制CDKL1可抑制肿瘤细胞的生长。由于肿瘤细胞的分裂均受细胞周期素调控，CDKL1很可能在恶性黑素瘤中也高表达，并参与恶性黑素瘤细胞生长的调控。本研究用RT-PCR方法检测CDKL1在两株人恶性黑素瘤细胞株A375和MV中的表达水平，发现A375和MV3细胞中CDKL1呈高表达。同时，构建CDKL1-RNAi慢病毒载体质粒，感染细胞，用qPCR检测mRNA水平的基因敲减效率，用Brdu试剂盒检测细胞增殖情况，用流式细胞术检测细胞周期与细胞凋亡，用克隆形成检测评估细胞的成瘤能力。结果显示，抑制CDKL1基因的表达，可抑制A375和MV3细胞增殖及克隆形成、促进细胞凋亡，并将细胞阻滞在G1期。这些结果表明，CDKL1基因与人恶性黑素瘤细胞的增殖、凋亡、克隆形成能力及细胞周期调节等有关，CDKL1基因可能成为恶性黑素瘤治疗的新靶点。