恶性黑素瘤细胞三维侵袭性生长模型的建立与评价

恶性肿瘤的侵袭特性是决定肿瘤转移、临床预后的关键。肿瘤三维培养模型将为肿瘤侵袭性研究提供新的技术手段。我们拟利用前期研制复方壳多糖组织工程皮肤所建立的良好技术平台，建立恶性黑素瘤（MM）的三维侵袭性生长模型。采用组织学、电镜、激光共聚焦等方法，研究不同时相点加入MM细胞、或与角质形成细胞和成纤维细胞不同浓度配比、不同葡萄糖浓度、静态与灌注等培养条件下，肿瘤团块形成和基底膜结构破坏的差异；同时采用ELISA、免疫印迹等方法检测侵袭过程中基质金属蛋白酶（MMP-2与MMP-9）和胶原酶的分泌水平；利用绿色荧光蛋白标记瘤细胞，动态观察MM三维培养模型中成瘤及侵袭过程；通过miRNA芯片和RT-PCR检测并验证MM侵袭性生长相关miRNAs，进而构建反义miRNA表达载体，观察转染瘤细胞的侵袭特性的变化，为今后MM的生物学特性和治疗药物研究及其它肿瘤三维培养模型的建立提供可靠的实验依据。

恶性肿瘤的侵袭特性是决定肿瘤转移、临床预后的关键。肿瘤三维培养模型将为肿瘤侵袭性研究提供新的技术手段。恶性黑素瘤是临床上侵袭性极高、转移发生早的恶性肿瘤。我们利用前期研制复方壳多糖组织工程皮肤所建立的良好技术平台，调整A375细胞接种方式和培养方法，在真皮基质内加入成纤维细胞时，在基质表面接种A375细胞和角质形成细胞，行气-液面交界培养2周后，可观察到黑素瘤A375细胞在真皮层形成细胞团块，随培养时间延长向下生长越深,成功建立皮肤恶性黑素瘤三维培养模型。免疫组化染色显示，真皮层的黑素瘤细胞E-Cadherin表达缺失，而PCNA、MMP-9的阳性表达，且表达强度与肿瘤侵袭深度及培养时间正相关。通过电镜可以观察到真皮中的黑素瘤细胞生长良好，瘤细胞间通过桥粒连接成细胞团，且与周围成纤维细胞间也存在连接。本研究建立的恶性黑素瘤体外三维培养模型，为今后深入研究MM的生物学特性和治疗药物研究及其它肿瘤三维培养模型的建立提供可靠的实验依据。