微生物甾醇侧链降解过程中母核降解机制研究与改进

Mycobacterium can metabolize phytosterol for cell growth as carbon and energy source and produce metabolites as pharmaceutical intermediates. In order to effectively transform phytosterol into steroidal pharmaceutical intermediates, nucleus degradation should be minimized in the process of transformation. Due to the lack of comprehensive knowledge of microbial side-chain degradation in biological mechanism and metabolic regulation, nucleus degradation in the process of phytosterol biotransformation is still a key problem to this new technology and lead to the loss of 10-20% of the substrate. This project will focus on the molecular mechanism of microbial side-chain degradation, annotation of related gene. The mechanism and metabolic pathway of nucleus degradation are studied by the way of bioinformatics and targeted metabolomic analysis based on nucleus degradation genes deletion mutants. For the purpose of reducing the degradation of nucleus and increasing the productivity of target production, the carbon metabolic flux and pathway should be optimized by analysis of molecular regulation in vivo, metabolism of phytosterol and interrelationship between them in the process of biotransformation which is the key problem of microbial side-chain degradation.

分枝杆菌能够代谢植物甾醇，提供菌体生长、代谢所需的碳源、能源，同时产生可作为医药中间体的代谢产物。为有效转化甾醇生产甾体医药中间体，在转化过程中应尽量提高微生物对甾醇侧链降解并减少降解母核。由于对微生物甾醇侧链降解的分子生物学机制以及过程调控机制缺乏全面了解，甾醇转化过程中母核降解依然是困扰该技术发展的难点问题，约有10-20%的底物被完全降解。本课题以所获分枝杆菌为研究模型，拟对甾醇侧链降解过程的分子机制进行深入研究，注解该过程的相关基因，并以在此过程中所产生的母核降解关键基因缺失突变菌株作为基础，利用生物信息学和靶向代谢组学分析甾醇母核的代谢机制和通路，综合细胞内的分子调控机制与微生物甾醇转化过程中的侧链降解代谢、能量代谢协调机制，对微生物侧链降解甾醇过程中的关键问题进行分析、改造，优化微生物细胞碳代谢通路，从而调节碳代谢流的流向及通量，减少产物母核降解，提高目标代谢产物的产率。

分枝杆菌降解胆固醇、植物甾醇侧链生成甾体药物中间体AD、ADD、9-OH-AD等化合物已逐渐成为甾体药物合成的重要手段。甾醇侧链降解过程是一个由多酶系参与的连续酶促反应，以提供菌体生长、代谢所需的碳源、能源，并最终被完全降解。为有效转化甾醇生产甾体医药中间体，在转化过程中应尽量提高微生物对甾醇侧链降解并减少降解母核。所以，因微生物代谢产生的母核降解是影响转化效率和工业化应用的关键问题之一。针对此问题，本课题从代谢途径分析和代谢过程调控出发开展了以下的研究工作：.通过鉴定、分析确定了分枝杆菌中存在的主要母核降解相关基因（kstD和ksh）；通过对影响母核降解的关键基因kstD1，kstD2，kstD3单基因和多基因缺失突变株生物转化过程研究，靶向代谢组技术研究突变菌株甾醇代谢情况，分析和确证了其在甾醇转化中的影响母核降解的关键作用；同时，研究了其酶促动力学特征，确定了在菌体培养过程中影响其转录表达的各种条件参数，并以此为研究结果基础，制定了两段式转化过程调控策略，减少了母核降解。.建立了分枝杆菌碳源共代谢模型，研究了葡萄糖、柠檬酸、乙酸钠等碳源与甾醇共代谢条件下微生物反应动力学特性差异，解析了菌体基础代谢、能量代谢与侧链降解的相关性与调控机制。通过代谢组学分析，明晰了在生长细胞和静息细胞条件下碳源共代谢对甾醇侧链降解代谢流分布的影响，证明了采用碳源共代谢调控方法可以降低菌体1位脱氢活力，从而降低甾醇的过度降解。.另外，实验还发现转化体系中添加维生素，提高反应体系溶氧水平可以提高菌体侧链降解的转化反应速率、减少转化反应时间，同时减少母核降解。因此，这种反应动力学差异导致的母核降解减少也是一种有效的方式。基于此，在两段式生物转化过程基础上，通过优化菌体培养条件提高菌体活性，优化反应体系和反应条件参数，进一步提升了生物转化反应速率，减少母核降解现象。同时，还建立了可循环利用菌体和环糊精的半连续生物转化过程，简化了流程，降低了成本。.综合上述研究内容，项目研究从代谢过程分析、组学分析和代谢调控分析三个角度入手，对植物甾醇侧链降解途径中母核降解相关机制与调控机理进行了研究，揭示其内在规律，并以此为依据建立了分枝杆菌转化植物甾醇的过程调控策略，使得生物转化过程母核的降解降低到10%左右。