基于小角X射线散射技术的黄病毒RNA的结构、动态特性及其与蛋白质相互作用的研究

Mosquito-borne flaviviruses, such as zika (ZIKV), dengue (DENV) and west nile (WNV) viruses, are single-stranded positive-sense RNA viruses that cause thousands of human death and millions of illness each year, raise a major impact on human health and are serious concern in many parts of the world. The genome consists of a single open reading frame which was flanked by 5’ and 3’ untranslated regions (UTR). Structured RNA elements, such as xrRNA1, DB1/DB2 and DENV-MINI, which are located within both of the 5’ and 3’ UTRs， or part of the coding regions, are found to be essential for subgenomic flavivirus RNA (sfRNA) biogenesis, genome cyclization, initiation of RNA synthesis, pathogenesis and immune evasion, but little is known about their structures, dynamics and interactions with both host and virial proteins. Small angle x-ray scattering (SAXS) is an powerful technique in RNA structural characterization, in this project, we propose to develop a novel site-specific labeling method based on unnatural base parirs that can be used to incorporate gold nanoparticles into large RNAs for x-ray scattering interferometry (XSI) experiment, which is a new SAXS method that can measure intra/inter- molecular distance up to 500 Å. We propose to upgrade the instrument at beamline BL19U2 of SSRF for sub-ms time-resolved small angle x-ray scattering (TR-SAXS). By combined use of traditional SAXS, TR-SAXS, XSI and computation, we propose to study the solution structure of a large RNA, DENV-MINI, the folding mechanism of ZIKV-xrRNA1, the interactions between DB1/DB2 and the host protein DDX6, between ZIKV-MINI and the virial proteins (NS5/NS3), respectively. Our results will highlight a novel protocol for structural studies of large RNAs and its protein complexes by small angle x-ray scattering, further understanding of the structures and interactions of flavivirus RNAs with proteins, and provide insight into RNA-targeted drug discovery.

蚊媒黄病毒包括寨卡病毒等都是单股正链RNA病毒，对人类健康造成严重威胁，在全世界引起了极大关注。许多黄病毒RNA可形成高级结构，在亚基因组RNA的生成、基因组的环化、RNA的复制、以及对宿主的免疫反应中发挥关键作用，但目前对其结构、动态特性及其与宿主或病毒蛋白的相互作用知之甚少。小角X射线散射技术可在RNA的结构与功能研究中发挥重要作用， 本项目中，我们将发展开展X射线散射干涉实验必需的对长链RNA位点特异性标记金纳米颗粒的样品制备方法，将综合运用多种小角X射线散射实验方法，开展DENV-MINI的溶液结构，寨卡病毒xrRNA1的折叠机制， DB1/DB2与DDX6相互作用，以及ZIKV-MINI与NS5/NS3相互作用的研究。我们的工作将为基于小角X射线散射技术的RNA结构研究提供新实验方案，并为深入理解黄病毒RNA的结构，动态特性与功能, 以及开展以RNA为靶点的药物设计提供依据。

蚊媒黄病毒包括登革病毒、寨卡病毒和西尼罗河病毒等可在人群中引起感染，并导致一系列潜在的严重疾病。黄病毒是单股正链具有包膜的RNA病毒，其基因组RNA包含一个开放阅读框编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白，以及开发阅读框两侧可形成复杂的高级结构的非翻译区。非翻译区可作为顺式作用元件，通过与病毒蛋白或宿主蛋白相互作用，调控病毒的翻译，复制与致病过程。由于仍缺少针对这些病毒的有效的药物和疫苗，黄病毒的传播仍持续在全球形成健康威胁。开展黄病毒RNA的高级结构、构象动态、相互作用与功能的关系研究，对于理解黄病毒RNA的生理功能，以及开发基于RNA的生物疗法具有重要意义。相比于蛋白质，应用传统的结构研究方法开展RNA的高级结构研究更具有挑战性，为此，需要发展新的RNA结构研究方法。在本项目中，(1) 我们首先发展了基于NaM-TPT3非天然碱基核苷酸系统的长链RNA位点特异性标记金纳米颗粒、荧光探针和自旋探针的技术，奠定了应用X射线散射干涉(XSI)，单分子荧光共振能量转移(smFRET)和电子顺磁共振(PELDOR)开展长链RNA高级结构与构象动态特性研究的基础；(2) 结合位点特异性自旋探针标记技术和RNA全氘代，我们发展了基于PELDOR的长链RNA分子内长距离测定的方法，突破了当前长链RNA长距离测定的极限；（3）通过联用小角X射线散射(SAXS)、PELDOR和计算模拟，我们从长链RNA的二级结构出发，发展了长链RNA高级结构研究的整合方案，为开展长链RNA的高级结构研究提供了新的思路；（4）结合SAXS, 单分子纳米孔和smFRET, 我们研究了寨卡病毒xrRNA1的力学各向异性的分子基础和黄病毒xrRNA构象动态的调控机制；（5）结合SAXS、氢氘交换质谱、定点突变和等温滴定量热，我们研究了寨卡病毒xrRNA2与宿主蛋白Musashi-1相互作用，揭示了寨卡病毒神经嗜性的的结构基础；（6）我们在上海光源BL19U2线站搭建了时间分辨小角X射线散射装置，为开展RNA的折叠动态研究奠定了基础。（7）基于已有研究成果，我们发表了10篇论文，获得一项专利授权。其它研究工作仍在进行中，后续将继续整理相关成果予以发表。