基于尿卟啉原III甲基转移酶CysGA的新型蛋白质稳定性检测探针的开发与应用

Proteins are the main research targets for biological science, bioengineering, pharmaceutical science, and so on. They are also an important source of innovation in many fields such as bioenergy conversion and industrial biocatalysis. However, proteins are intrinsically unstable, which limited their characterization and application, and is also one of the major causes of protein misfolding and aggregation. To provide a new means to stabilizing proteins with directed evolution techniques, we intend to develop a novel in vivo biosensor based on the uroporphyrinogen III methyltransferase, CysGA, from Escherichia coli. CysGA catalyzes red fluorescent substances formation in E.coli from endogenous substrates. We previously found that the fluorescence identity of the cells positively correlated with the stability of test proteins fused to CysGA, indicating the potential to adapt CysGA into a protein folding sensor. We will screen the surface exposed residues in CysGA to find the sites suitable for foreign protein insertion, making a sandwich fusion between the target protein and CysGA. Then, we will explore the application of this system in the following aspects: 1. Obtaining stabilized variants of two target proteins in order to promote their structural and mechanistic characterization; 2. Screening a small molecule library to find new types of inhibitors for hIAPP amyloid formation, which will provide new ideas for the treatment of type-2 diabetes and other protein folding diseases.

蛋白质是生命科学、生物工程、医学制药研发的主要对象，也是生物能源转化、工业生物催化等多个领域的重要创新源泉。但是，蛋白质的内在不稳定性限制了其表征与应用，也是导致蛋白质折叠异常、诱发疾病的重要原因之一。 本项目拟开发新型蛋白质体内稳定性检测探针，为利用定向进化技术优化蛋白质稳定性提供新的手段。大肠杆菌中尿卟啉原III甲基转移酶CysGA催化内源底物产生红色荧光，我们发现将其与不同目标蛋白融合表达时，其荧光表型与目标蛋白的稳定性呈正相关性。根据这一现象，我们拟筛选CysGA表面位点，将其进行拆分以打造“三明治”形式的插入型探针，进一步提升蛋白质稳定性筛选的效率。后续在两个方面考察CysGA探针系统的应用：1. 获取两种目标蛋白稳定性提升的突变体，以促进其结构与机制表征；2.筛选化学小分子库，获取抑制淀粉样纤维生成的新型小分子，为治疗2型糖尿病等蛋白质折叠疾病提供新的思路。

蛋白质发挥功能需要借助正确的空间结构，而蛋白质的内在不稳定性使得它们极易丧失结构与功能。因此，提升蛋白质的稳定性、促进蛋白质的正确折叠具有重要的科学意义和工业应用价值。然而与众多体外检测方法相比，可直接检测活细胞中蛋白质折叠状态的研究手段仍非常有限，亟待开发新型表征技术。在本项目的资助下，我们以大肠杆菌尿卟啉原III甲基转移酶CysGA为报告蛋白，开发了一种新型蛋白质折叠检测探针，将蛋白质的胞内稳定性与易于检测的细胞表型偶联起来，具有高通量、高分辨率、高灵敏度、适用面广等优点，成为利用定向进化技术改造蛋白质稳定性的有效工具。借助CysGA探针进行筛选，我们实现了3种可溶性蛋白以及1种淀粉样蛋白的稳定性改造，获得了1种可以耐受嗜热毛壳菌超高生长温度的新型抗性标签。同时，我们将这一筛选工具与深度突变扫描技术结合，针对重要人源蛋白组蛋白H3K4甲基转移酶MLL的催化结构域，构建了其单残基分辨率下的全局稳定性景观图，揭示了维持该蛋白稳定性的关键残基及稳定性改造热点区域。此外，我们还借助CysGA探针，从体内构建的五环肽文库中，筛选到了淀粉样蛋白hIAPP的沉淀抑制剂。本项目的研究为在活细胞内检测、操纵蛋白质的稳定性提供了独特而有效的工具，在蛋白质科学研究、工程应用等领域具有重要价值，在蛋白质折叠相关疾病的药物开发上也具有潜在的应用前景。