基于智能荧光探针的DNA甲基转移酶活性检测及其在白血病研究中的应用

DNA methylation catalyzed by DNA methyltransferase is an important epigenetic event that plays crucial roles in gene transcription and expression, genomicimprinting, embryogenesis, and maintaining normal cell function. Furthermore, DNA methylation and the activity of DNA methyltransferase are associated with many serious diseases in humans, such as cancer, and genetic diseases. The aim of this project is to develop a simple rapid and sensitive approach used for the detection of DNA methylation level, analysis the activity of DNA methyltransferase, and evaluation and screen of the inhibitors of DNA methyltransferase by the combination of fluorescent molecular probes, biotechniques and oncology. The screening of the inhibitors of methyltransferase can be achieved based on the developed method and maybe help for the discovery of anticancer drug. To explore the effect of methyltransferase inhibitor, 5-Aza-2-deoxycytidine on biological behaviors of Human Promyelocytic Leukemia Cells HL-60, in order to investigate the mechanism and to provide principle of its application in clinically treating Leukemia. This purpose of this project is not only to enlarge the applications of bioanalytical methods, but also to provide important potential techniques for the studies of clinical medicine and molecular biology.

DNA甲基化是表观遗传改变的主要作用方式，在基因表达调控、基因组印迹、胚胎发育、维持正常细胞功能等过程中起着极其重要的作用。人类许多重大疾病如癌症、遗传性疾病都与DNA甲基化以及甲基转移酶的活性密切相关。本项目针对DNA甲基化研究，结合荧光分子探针技术、生物技术以及肿瘤学等多学科知识建立一种简便、快速、灵敏的DNA甲基化检测、DNA甲基转移酶活性分析以及与DNA甲基化相关抗癌药物的筛选平台。进一步探索甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷对白血病细胞生物学行为的影响，为阐明药物作用白血病细胞株HL-60的机制、白血病的临床治疗提供理论基础。本项目的开展不仅是生物分析化学方法的拓展，而且为临床医学和分子生物学研究提供了一种有重要应用前景的新技术。

在本项目的资助下，主要取得了以下研究成果：（1）基于智能荧光探针，发展了一种简便、快速检测DNA甲基转移酶活性检测新方法：甲基化酶和相应的限制性内切酶的识别位点被设计在发夹型探针的茎部，荧光素(FAM)被连接在探针的5'端，其荧光被连在3’端的四个连续G碱基所熄灭。限制性内切酶可切割未发生甲基化修饰的探针，导致探针的发夹结构遭到破坏，引起FAM荧光信号增加，即可实现对甲基化酶活性的分析。在此基础上，建立了一种简便、快速分析抗肿瘤药物（如5-氮杂胞苷(5-Aza)和5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)、硫酸庆大霉素等）对DNA 甲基化酶活性的影响的方法，为筛选针对基因甲基化异常引起的恶性肿瘤的治疗药物提供了一种新的思路和方法。进一步考察了甲基化酶抑制剂5-Aza和5-Aza-CdR对白血病细胞HL-60增殖及凋亡的影响。结果表明药物对HL-60的生长抑制表现为浓度和时间依赖性，一定剂量的药物诱导细胞凋亡。(2) 基于智能荧光探针，结合DNA连接，发展了一种发展了一种简便、灵敏的生物小分子ATP的传感检测新方法。该方法灵敏，简单，其线性响应范围为1~300 nM, 检测下限为0.14 nM。并利用该方法对细胞内的ATP水平进行了初步分析。(3) 基于单标记智能荧光探针，结合lambda exonuclease，发展了一种简单、便宜、灵敏的T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK）检测新方法。其线性响应范围为0.01-10 U/mL，检测下限为0.01 U/mL。并探讨了酶抑制剂对T4 PNK活性的影响，为T4 PNK抑制剂筛选提供了新的思路和方法。因此，本项目拓展了智能荧光探针在生物医学领域的应用。