基于条件性表达Cas9基因修饰猪的原发性肿瘤模型建立

The animal models are necessary tool for studies on the mechanism of caner and developing new drugs. The most traditional cancer models are implanted models based on immune-deficient mice. However, most cancers are intrinsic in patients with normal immune system. With technology of genetic modification, animal genome can be mutated to induce cancer and subsequently cancer animal models can be established, which are intrinsic and with normal immune ability. Pigs, which are more similar to humans in physiology, immune system and metabolism, are more suitable animal models for cancer. In the project, we plan to employ TALEN to insert Cas9 into porcine ROSA26 locus and produce pig models conditionally expressing Cas9. The vectors of gRNA and genes which are related to lung cancer and liver cancer will be introduced to lung and liver respectively, mediated by lentivirus or adenovirus. Mutation of multiple genes is expected. Subsequently, the intrinsic pig caner models, which will mimic the human caner more properly, can be established. These porcine cancer models will provide an excellent tool for study of cancer.

癌症动物模型是研究癌症发生、发展机制和开发抗癌新药不可或缺的工具。传统的癌症动物模型，大多数是基于免疫缺陷小鼠的植入性模型，而绝大多数癌症病人具有免疫能力，其肿瘤是原发性的。利用基因修饰技术，对动物基因组进行癌化突变，即可建立免疫能力正常的原发性肿瘤动物模型。猪的免疫系统、生理、代谢等方面与人较为接近，是癌症研究的理想实验动物。本项目利用新近发展起来的高效基因编辑技术TALEN，将Cas9插入到猪基因组的ROSA26位点，构建条件性表达Cas9基因工具猪模型，然后，在其肺脏和肝脏分别导入腺病毒包装的含有gRNA和诱导肺癌基因和肝癌基因的载体，使其组织发生条件性多基因致癌突变，从而建立能够真实模拟人类癌症发生发展的基因修饰原发性肿瘤猪模型，为人类癌症研究提供更优越的工具。

癌症动物模型是研究癌症发生、发展机制和开发抗癌新药不可或缺的工具。传统的癌症动物模型，大多数是基于免疫缺陷小鼠的植入性模型，而绝大多数癌症病人具有免疫能力，其肿瘤是原发性的。利用基因修饰技术，对动物基因组进行癌化突变，即可建立免疫能力正常的原发性肿瘤动物模型。猪的免疫系统、生理、代谢等方面与人较为接近，是癌症研究的理想实验动物。目前，制备基因修饰猪模型主要依赖于受精卵注射或体细胞核移植技术，耗时、耗力，且成本高，亟需构建可用于直接体内基因修饰的工具猪模型。.我们首先利用基因打靶技术，成功地将Cre依赖表达Cas9元件插入到猪基因组ROSA26位点，Cre依赖表达Cas9元件包括一对反向的loxP位点、一对反向的突变loxP2272位点、剪切受体（SA）、无启动子的Neo抗性基因表达框、反向的SpCas9-T2A-tdTomato (iCas9)表达框。在Cre重组酶的作用下，SpCas9可在内源启动子启动下表达。利用此工具模型，不需要依赖受精卵注射或体细胞核移植技术，在动物体内转入能识别特定基因的gRNA和重组酶，就可直接对猪的基因组进行编辑，从而快速获得相应基因编辑猪模型。 .我们接着将包装的含有Cre重组酶和靶向六种肿瘤相关基因的gRNAs慢病毒通过滴鼻方式，感染工具猪的肺脏，在猪肺细胞的基因组发生癌化突变。三个月后，猪出现了典型的肺癌症状和病理变化，从而成功地建立了原发性肺肿瘤大动物模型，真实模拟人类癌症发生发展，为人类癌症研究提供更优越的工具。.利用条件性表达Cas9基因猪模型，可高效的实现大动物体内细胞单基因、多基因、超大片段基因的编辑。这一研究成果将推动猪基因功能的研究进展和加快在生物医药及农业领域有重要应用价值的基因修饰猪模型的建立。