姜黄素下调耐药肿瘤细胞高表达Keap1-Nrf2通路的作用及机制

Activation of the Keap1-Nrf2 signaling pathway is the hallmark during self-defense of cancer cells against chemotherapeutic agents. Over expression of Phase Ⅱ genes (NQO1, GSTs ) and/or drug efflux pumps (MRPs) targeted by Nrf2 is the outcome of the activation, which facilitates the drug resistance of cancer cells. In the past two decades, curcumin was reported to reduce the resistance of cancer cells to different chemotherapeutic agents in vivo or in vitro. But its effect on the Keap1-Nrf2 pathway in drug-resistant cancer cells is still unknown.We propose the hypothesis that curcumin may down-regulate the pathway and plan to take the following processes to prove it. Drug-resistant cell lines will be firstly built with human prostate cancer PC3 cells or pancreatic cancer MiaPaca2 cells. The effect of curcumin decreasing Nrf2 and/or increasing Keap1 will be verified on them. This effect will be tested further through transfecting wild type Nrf2 to drug-nonresistant cells, which will acquire drug resistance with a high level of Nrf2. To investigate whether curcumin decreases Nrf2 depending on Keap1, nonresistant cells will be transfected with Keap1 siRNA to achieve a high level of Nrf2. Finally, the tumor-bearing mice will be built with the same drug-resistant cell lines and down-regulation effect of curcumin on the pathway will be verified repeatedly in vivo.

为抵抗化疗药的攻击，肿瘤细胞的Keapl-Nrf2通路过度激活，过高的Nrf2使其介导的二相抗毒酶及药物流出泵表达增高，从而提高了肿瘤细胞的耐药性。姜黄素被证实可降低肿瘤细胞的耐药性，此作用可能与其下调耐药肿瘤细胞高表达的Keapl-Nrf2通路有关。为揭示该机制，本项目拟开展：1.构建前列腺癌PC3、胰腺癌MiaPaca2耐药细胞系，探索姜黄素降低Nrf2及增强Keap1的作用及机制；2.给不耐药肿瘤细胞转染外源Nrf2使之获得耐药性，再研究姜黄素降低Nrf2及增强Keap1的作用及机制；3.给不耐药肿瘤细胞转染Keap1 siRNA，使Nrf2得不到Keap1介导的降解而增高，细胞获得耐药性，探索姜黄素降Nrf2的作用依赖于Keap1；4.用同种耐药细胞构建裸鼠移植瘤，在动物体内验证姜黄素对耐药肿瘤细胞Keap1-Nrf2通路的下调作用：通过增强Keap1的功能或表达来降低Nrf2。

肿瘤细胞为了抵抗化疗药物的攻击，其Keapl-Nrf2通路处于过度激活状态, 高水平的Nrf2使它所介导的二相抗毒酶表达增高，从而增强了肿瘤细胞的耐药性。因此下调Keapl-Nrf2通路（降低Nrf2的表达）是治疗耐药肿瘤的新途径，但目前还没有找到有效的物质。姜黄素可协同多种化疗药物治疗肿瘤，降低肿瘤细胞的耐药性，这种作用是否与它下调耐药肿瘤细胞的Keapl-Nrf2通路有关？本项目将对此进行研究。 .本项目首先利用抗肿瘤药顺铂作用膀胱癌T24细胞，导致Keap1-Nrf2通路高表达，然后发现姜黄素可降低此通路的表达，其机制是姜黄素增加了Keap1表达，从而降低了转录因子Nrf2水平以及Nrf2所介导的对外来毒性物质的抵抗；为了进一步验证姜黄素对高表达Keap1-Nrf2通路的下调作用，我们利用H2O2刺激的MRC-5细胞，制作Keap1-Nrf2通路高表达模型，同样发现姜黄素可降低此通路的表达，其机制是姜黄素增加了Keap1的水平；为了探究姜黄素对高表达Keap1-Nrf2通路下调作用的机制，我们研究了Keap1-Nrf2与自噬的关系，发现A549 DDP细胞中Keap1-Nrf2与自噬水平均被上调，姜黄素与可将高水平的Keap1-Nrf2与自噬恢复到正常水平，从而逆转A549 DDP细胞对顺铂的耐药性。.本研究意义：○1发现姜黄素下调耐药肿瘤细胞Keap1-Nrf2通路的作用，为进一步开发该通路的抑制剂提供基础； ○2姜黄素类抗氧化药物可激活Keap1-Nrf2通路以保护正常细胞，预防肿瘤的发生；但对于Keap1-Nrf2通路已高度激活的肿瘤细胞，本研究发现姜黄素对该通路有下调作用，合理解释了此类药物“保护正常细胞，但不保护肿瘤细胞”的矛盾；○3进一步阐明姜黄素降低肿瘤细胞耐药性的机制，为姜黄素类药物协同抗肿瘤提供理论依据，有利于对它们的开发和利用。