一种基于TBSV的植物RNA病毒载体表达系统的研究

作为一种有潜力的新型平台，植物RNA病毒载体表达系统在短时间内可生产大量成本低廉、安全的目的蛋白。因此，利用该系统在植物中表达外源基因，尤其是生产医用蛋白和疫苗具有重大的商业价值。近年来，国际上在这一研究领域取得了一些突破，但是稳定、高效、具有商业开发前景的种类较少，且研究中存在的一些共性问题的解决，都需要进一步开发新种类的病毒载体表达系统。番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus, TBSV）在生物安全性、外源基因承载能力和表达高效性上都具有其他植物RNA病毒无法比拟的潜在优势。近年来，TBSV分子生物学研究的巨大进展，使得利用TBSV建立稳定、高效的病毒载体表达系统成为可能。本项目以TBSV为实验材料，在对植物RNA病毒载体表达系统中关键环节深入研究的基础上，建立一种稳定、高效的植物RNA病毒载体表达系统。同时为解决该领域研究中目前普遍存在的问题提供一些新的思路。

本项目着眼于植物RNA病毒载体表达系统在医用蛋白和疫苗生产中潜在的商业前景和价值，针对目前该研究领域存在的病毒表达载体种类少，急需发展新类型植物病毒载体表达体系的迫切需求，以番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus, TBSV）为对象，从整株、细胞和分子水平等三个层次对植物RNA病毒载体表达系统中病毒载体设计、筛选与优化以及RNA沉默抑制子对病毒载体表达系统的作用等关键环节进行深入研究，并通过与其它两个植物RNA病毒瞬时表达系统的比较研究，对新建立的TBSV病毒载体表达系统进行了综合评价。研究发现，（1）建立了适用于TBSV重组病毒载体的农杆菌转化和农杆菌渗透接种技术；（2）证明TBSV病毒编码的移动蛋白基因p22可能在TBSV浸染寄主本氏烟植株时具有不可或缺作用；（3）从构建的3个类型6个Ⅱ型启动子介导转录的TBSV病毒表达载体中优选出1个表达载体并确定其在植物中表达的时间变化规律；（4）首次克隆了本氏烟Ⅰ型启动子序列，在体内确定其转录起始位点的基础上，构建了Ⅰ型启动子介导转录的TBSV病毒表达载体；（5）本氏烟Ⅰ型启动子介导转录的TBSV病毒载体的表达效率高于Ⅱ型启动子介导载体，且Ⅰ型启动子通过缩小TBSV病毒表达载体的寄主范围，在一定程度上提高了病毒载体表达系统的生物安全性；（6）构建了7种不同类型植物病毒编码的RNA沉默抑制子瞬时表达载体；（7）共表达实验表明， RNA沉默抑制子可以通过抑制病毒诱导的RNA沉默来提高外源基因在植物中的表达水平和表达持续时间，但是不同沉默抑制子对其共接种病毒载体介导的外源蛋白表达水平的增效作用强弱和作用持续时间长短显著不同，因此不同的植物病毒载体表达系统需要通过筛选获得其最佳的共表达抑制子“伴侣”；（8）建立起了利用TBSV病毒表达载体在寄主植物烟草中表达外源蛋白的技术体系，研究结果对于“感兴趣基因”的表达和研发，提供了一条快速高效的新途径。研究结果对于深入了解植物RNA病毒表达载体系统，为解决该领域研究中目前普遍存在的问题提供了一些新的思路，进而对指导其它具有商业价值的外源基因表达产生理论意义和实际应用价值。