利用TMV在烟草中高效表达rPA（Reteplase）

急性心肌梗塞、脑梗塞等血栓栓塞性疾病的致残率和致死率都很高，严重威胁着人类健康及生命。临床上，以溶血栓为主的溶栓药物疗法是治疗血栓疾病的主要方法。第三代溶栓药物rPA商品化生产中存在成本高、价格昂贵的问题，探索和研究新型、高效的表达系统，是降低成本的关键。此外，利用基因工程技术进一步对溶栓药物进行分子优化和改造，使之更加符合临床需求，也需要一个简易、高效的表达体系作为技术支撑。本项目针对溶栓药物研究和生产中存在的问题和需求，本项目拟利用新一代烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）载体表达系统和最新的蛋白质体（Protein Bodies）表达技术在绿色植物烟草中高效地表达和生产rPA。在获得植物病毒瞬时重组表达载体的基础上，最终建立起适用于药物研究和生产开发的、具有自主知识产权的新型体系，对开发出高效、低毒、廉价的新型药物具有很大的社会意义和和和实际应用推广价值。

血栓栓塞性疾病严重威胁着人类健康，溶栓药物疗法是临床上治疗血栓疾病的主要方法。以Reteplase为代表的第三代溶栓药物在商品化生产中存在成本高、价格昂贵的问题，探索新型高效的表达系统是降低成本的关键。此外，对溶栓药物的分子优化和改造，也需要简易、高效的表达体系作为支撑。针对以上溶栓药物研究和生产中存在的问题，项目利用烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）载体表达系统和蛋白质体（Protein Bodies, PBs）技术，从表达载体的构建与优化、表达、重组表达产物的纯化和其纯化产物理化性质及体外活性等方面，开展了在植物中表达Reteplase的研究。研究发现，①共表达RNA沉默抑制子（RSSs）可以抑制VIGS进而提高外源基因的表达水平，且不同RSSs对其共接种病毒载体介导的外源蛋白表达水平的作用不同；②聚合酶Ⅱ转录的sRNA可以竞争性地抑制宿主抵御病毒入侵相关蛋白合成的mRNA的核质运转，进而对病毒载体表达系统有明显的增效作用；③两种蛋白质体技术（Zera和HFBI）均能通过形成PBs颗粒隔绝细胞内源性蛋白酶对目的表达产物的降解而显著提高外源基因在植物中的积累。但PBs颗粒特性的差异使得HFBI技术更适用于Reteplase的表达；④融合PBs和病毒载体技术的Reteplase表达系统，在烟草细胞中没有形成PBs颗粒，推测TMV病毒载体表达体系与PBs表达技术不相容；⑤利用TMV病毒表达载体可以在本氏烟中表达有生物学活性的Reteplase，证明利用植物作为生物反应器生产Reteplase可行；⑥重组Reteplase的空间表达结果表明，表达效率从高到低依次为内质网、胞外分泌和细胞质；⑦信号肽、密码子、RSSs和标签Strep II的位置对TMV病毒载体介导的Reteplase在植物中表达效果均有不同程度的影响；⑧重组Reteplase于接种后第5天在植物中开始表达，随时间的推移表达量逐渐升高。在接种后第9-11天达到最高，最大表达量约为25.0 μg/g鲜叶；⑨用Strep II标签可以纯化出高纯度的重组Reteplase，其生物学活性与市售原核表达的商品化Reteplase的活性相当。研究结果对于研究和开发高效、廉价的溶栓药物具有借鉴价值。同时，相关机理研究对深入了解植物病毒载体表达系统和指导其它“感兴趣基因”的表达具有理论意义。