氮胁迫条件下稻瘟病菌致病性分泌蛋白的鉴定

研究证实氮胁迫条件可以诱导稻瘟病菌致病相关基因的表达。申请者在前期筛选获得了稻瘟病菌株CH-63,该菌株在氮胁迫与非氮胁迫条件下能够产生致病力差异显著的分泌蛋白。本项目拟在此基础上通过二维凝胶电泳技术和定量质谱技术对该菌株在这两种营养模式条件下分泌蛋白表达谱进行分析,采用肽质量指纹图谱和蛋白质数据库同源性比较对差异蛋白进行鉴定,同时根据稻瘟病菌全基因组测序结果和生物信息学资源,分析出其中具信号肽,属于典型分泌蛋白的基因8～10个。设计引物并对该菌株总RNA进行RT-PCR扩增，扩增产物克隆后利用酵母表达系统（pYES2.1/V5-His-TOPO）进行表达,表达产物经鉴定纯化后进行致病功能验证。利用持不同抗病基因的IRRI水稻单基因系,对该致病性分泌蛋白作用后致病谱差异、病程发展变化、生理生化机制等互作关系进行细致分析,为持续控制稻瘟病提供理论依据。

构建了稻瘟病菌在完全培养以及氮胁迫培养条件下双向电泳图谱。完全培养条件下检测到稻瘟病菌分泌蛋白有862个蛋白点，缺氮培养条件下检测到884个蛋白点。比对分析发现非氮胁迫条件下有27个蛋白表达上调，氮胁迫条件下有40个蛋白表达上调。对这67个蛋白进行筛选，获得差异显著性分泌蛋白候选基因10个，分别是Q8、Q16、Q17、Q19、Q20、Q24、Q32、Q33、Q38、Q39。候选基因经克隆表达后获得1个致病相关分泌蛋白Q16。该蛋白引起水稻叶片形成坏死性病斑。检测该蛋白作用感病品种蒙古稻后SOD、POD、CAT、MDA酶活变化，发现这4种酶在较短时间时间内均比对照明显升高。这一结果表明该蛋白造成了水稻细胞的损伤，对水稻具有致病性。通过致伤接种以及酶活检测可以确定该蛋白是一个在氮胁迫条件下稻瘟病菌产生的致病相关分泌蛋白。