功能蛋白质组学样品制备方法的研究及在鹿茸活性蛋白质筛选中的应用

Functional proteomics is one of the most important research areas in post-genomic era. Extensive extraction of proteins and the preservation of their activities is a critical step for functional proteomic analysis of biosamples, especially for cartilage tissue. The chondrocytes are surrounded by extracellular matrix, which makes it difficult to extract proteins from cartilage tissue. Therefore, it is highly necessary to develop efficient methods for protein extraction from cartilage tissue. Here we described a method for separation of the cellular components and cartilage extracellular matrix through sample freeze-sectioning and osmolality shock, followed by a sequential protein extraction method for large-scale extraction and prefractionation of activity-remaining proteins. Thereafter, the fractions were separated by different chromatographic techniques and assessed for their activities of promoting the proliferation of HUVEC. In addition, proteome analysis was applied to analyze the ingredients of the fractions with obvious activity, which facilitated the determination of active protein groups. This method was developed for extraction of proteins from cartilage tissue of velvet antlers; it should also be easily applied to the cartilages of other species.

在功能蛋白质组学研究中，如何在保持活性的前提下，实现蛋白质的提取分离是亟需解决的关键问题之一。然而在软骨组织中，由于细胞成分被包埋在细胞外基质中，造成细胞类蛋白质提取效率较低且易受细胞外基质组分的干扰。针对这些问题，本项目拟选择我国传统动物药鹿茸为研究对象，发展软骨组织中功能蛋白质的提取分离新策略，其中包括：1)采用渗透压冲击法选择性提取软骨组织切片中的细胞成分，实现其与细胞外基质的分离,进而应用多种非变性试剂，实现蛋白质的全面提取及初步分级；2）应用人脐静脉内皮细胞模型评价活性，从而筛选出活性明显的蛋白质组分；3)采用多种正交色谱分离技术，在活性示踪下，对活性组分进行逐级分离；4)应用蛋白质组学技术，对活性组分进行鉴定及功能分析，确定活性蛋白质群。本项目发展的渗透压冲击法提取蛋白质、非变性试剂分级处理和基于活性筛选的多维分离策略有望为深入开展软骨组织的功能蛋白质组学研究提供技术支持。

在软骨组织中，由于细胞成分被包埋在细胞外基质中，造成细胞类蛋白质提取效率较低且易受细胞外基质组分的干扰。而细胞类成分和细胞外基质成分可能具有差异巨大的功能。针对这些问题，本项目拟选择我国传统动物药鹿茸为研究对象，发展软骨组织中功能蛋白质的提取分离新策略，对应用活性筛选模型对其中的活性蛋白质进行筛选，同时应用蛋白质组学技术对鹿茸软骨组织进行全面的分析，进而通过生物信息学分析寻找血管生成及干细胞生长过程中的关键调节因子。在本研究中我们实现了：1)采用渗透压冲击法选择性提取软骨组织切片中的细胞成分，实现其与细胞外基质的分离，进而应用多种非变性试剂，实现蛋白质的全面提取及初步分级；2）应用人脐静脉内皮细胞模型，鼠骨髓间充质干细胞模型和鹿茸生发骨膜细胞模型评价活性，从而筛选出活性（促人脐静脉内皮细胞增值及血管样组织生成活性以及促干细胞增殖及干细胞特性维持的活性）明显的蛋白质组分；3)采用多种正交色谱分离技术，在活性示踪下，对活性组分进行逐级分离；4)应用蛋白质组学技术，对各组分进行鉴定及功能分析，确定活性蛋白质群。本项目发展的渗透压冲击法提取蛋白质、非变性试剂分级提取方法、基于离子液体的选择性提取方法、保持活性细胞外基质的制备方法、多种活性筛选细胞模型和多维分离策略有望为深入开展软骨组织的功能蛋白质组学研究提供技术支持。