外泌体高效富集与微量样品处理方法的建立及其在外泌体蛋白质组学研究中应用

Exosomes, found in all biological fluids, have become the focus of rising interest because of their numerous functions in physiology and pathology. Recent works have shown that the protein contained in the exosomes have important biological functions. However, the contamination of impurity protein in prepared exosomes and the low-abundance of exosomal protein present a great challenge to comprehensive understanding of exosomal protein and their biological significance. Therefore, it is of great importance to develop high selective enrichment method of exosomes and establish high-sensitivity and in-depth coverage quantitative proteomic method. Here, we intend to develop a novel strategy for the quantitative proteomic analysis of exsomes with high-throughput, in-depth coverage, high accuracy and high precision. 1) Develop an enrichment method of high purity exosomes and the methods is based on the combination of phospholipid bilayer-targeted functional molecule and polymer; 2) Develop a solid-phase alkylation regent based sample preparation method followed by pre-fractionation of enzymatic hydrolysate; 3) Establish a label-free proteomic quantitative analysis without dynamic exclusion. 4) The developed method was used for the quantitative proteomic of exosomes derived from urine of patients with renal interstitial fibrosis (RIF) and culture media of RIF cell model to identify the biomarker for early diagnosis of renal interstitial fibrosis.

外泌体广泛存在于各种体液中并参与众多生理学和病理学过程。近年来研究发现，外泌体蛋白质具有重要的生物学功能。然而，高纯度的外泌体不易制备且其中蛋白质的含量很低，对全面认识外泌体蛋白质及其生物学意义构成了巨大的挑战。因此，开发高选择性的外泌体富集方法、建立外泌体蛋白质的高灵敏度和深度覆盖的定量分析方法具有重要意义。我们拟通过发展基于细胞膜识别分子和聚合物分子协同作用的外泌体高选择性富集方法，开发基于离子液体和固相烷基化试剂的高效蛋白质预处理技术，并集成微量酶解产物预分级方法，研制外泌体蛋白质自动化样品预处理系统，通过与基于无动态排除的无标定量方法相结合建立外泌体蛋白质组定量分析策略，为实现外泌体蛋白质组的高通量、深度覆盖、高准确性和高精密度的定量分析提供重要技术支撑。此外，将其用于膜性肾病患者尿液和肾脏周细胞纤维化模型中外泌体的定量蛋白组学分析，为发现肾间质纤维化早期诊断标志物提供基础数据。

外泌体广泛存在于各种体液中并参与众多生理学和病理学过程。近年来研究发现，外泌体蛋白质具有重要的生物学功能。然而，高纯度的外泌体不易制备且其中蛋白质的含量很低，对全面认识外泌体蛋白质及其生物学意义构成了巨大的挑战。因此，开发高选择性的外泌体富集方法、建立外泌体蛋白质的高灵敏度和深度覆盖的定量分析方法具有重要意义。本项目基于外泌体的特性（尺寸、细胞膜结构）开发了多种外泌体富集方法。基于细胞膜亲和功能分子的硅球材料和磁性材料，基于尺寸的去除模板印迹材料和反向富集材料，实现了外泌体的高纯度，高回收率富集。发基于离子液体和固相烷基化试剂的高效蛋白质预处理技术，并研制外泌体蛋白质高通量预处理系统，结合无标定量方法和靶标蛋白定量方法建立外泌体蛋白质组定量分析策略，实现外泌体蛋白质组的高通量、深度覆盖、高准确性和高精密度的定量分析。应用上述方法分析IgA肾病、膜性肾病及健康人的尿液外泌体蛋白质组学，成功发现和标志物蛋白并实现疾病分型。对肾脏周细胞纤维化模型细胞与间充质干细胞外泌体的分析发现了外泌体影响周细胞纤维化的关键调控蛋白质。本研究为外泌体早期诊断标志物发现及其作用机制研究中提供关键技术支撑。.