TET蛋白的结构与功能研究

DNA methylation is one of the most important epigenetic regulations. TET protein was found to be involved in DNA demethylation and plays an important role in various biological and pathological processes, including development of leukemia. TET protein, TET interacting proteins, 5mC (substrate) and 5hmC, 5fC, 5caC (products) form a complex biological system, which is the most active field in the research of epigenetic regulation..The applicant has determined the crystal structure of TET2 in complex with methylated DNA (Cell, 2013, the applicant is corresponding author). The structural and biochemical analyses indicate that the cys-rich domain wraps around the DSBH domain to stabilize the catalytic core. The methyl-Cytosine is flipped out of the DNA double helix and inserted into the catalytic cavity. TET2 specifically recognizes CpG dinucleotide and has no preference on its flanking sequence. Patient-derived TET2 mutation significantly decreased the enzymatic activity or the stability of TET2 protein. .This application was proposed based on these previous results and other unpublished preliminary data. The applicant wants to continue the studies on TET and TET associated biological system with the support of this grant and Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF). The research will focus on the molecular mechanisms of TET-mediated catalysis, substrate recognition, and regulation of enzymatic activity. The studies will also reveal how TET proteins are involved in the tumorigenesis and provide a structural basis for designing of specific inhibitors or activators for functional studies and potential therapeutic applications.

哺乳动物DNA甲基化（5mC）是一种非常重要的表观遗传修饰，TET蛋白氧化甲基化修饰的DNA，调节体内DNA甲基化的动态变化，进而调控多个重要生物学过程，其失调也导致多种疾病，尤其是肿瘤和白血病。TET蛋白本身，TET结合蛋白，底物（5mC）和三种产物（5hmC，5fC，5caC）组成复杂的生物分子体系，针对这一复杂分子体系的研究是目前表观遗传学领域最为活跃的研究方向。申请人前期解析了TET2-DNA复合物结构并初步阐明了TET蛋白识别底物的机制（Cell，2013，唯一通讯作者）。本项目拟在前期工作的基础上，围绕以TET蛋白为中心的复杂分子体系，利用上海光源生物大分子线站，进一步深入开展结构与功能研究。阐明TET蛋白的催化，底物识别及酶活性调节的分子机制，揭示TET蛋白结构与功能的关系及其在癌症发生过程中的致病机理，项目的开展也将为靶向TET蛋白的药物设计奠定理论基础。

本项目以TET蛋白所形成的复杂生物分子体系为中心，系统的研究其结构与功能。项目经过4年的执行期，项目基本完成预期目标：充分结合大科学装置（同步辐射光源）的优势和特点，深入地研究了表观遗传调控关键蛋白TET及其所在的复杂生物分子体系的结构与功能，揭示TET蛋白酶活性调节机制。通过与上海光源，北京光源的深入合作，在结构生物学，表观遗传调控领域所取得的成果将有助于提升我国大科学装置的国际影响力。提升我国在DNA甲基化调控研究的国际影响力。.我们前期的研究解析了人源TET2与DNA（5mC）复合物的晶体结构（Cell，2013）。进一步研究发现，TET蛋白对三种DNA底物（5mC, 5hmC, 5fC）有明显的活性差异，就是对5mC的活性很高，而对5hmC，5fC的活性很低。酶活动力学实验进一步证明TET蛋白对5mC-DNA活性远远高于5hmC-/5fC-DNA。我们解析了TET2与5hmC-DNA (1.80 Å)，5fC-DNA (1.97 Å) 两种复合物的晶体结构。与TET2-5mC-DNA的晶体结构 (2.02Å)比较分析后发现：三个结构中胞嘧啶几乎处于一样的构象，但羟基，醛基因为受到分子间或分子内氢键作用，在催化中心指向不同方向，导致发生氧化的氢远离催化中心。生化实验表明，消氢作用是限速步骤。动力学模拟表明，在发生氧化反应中，5hmC、5fC在催化中心受到限制，不容易发生消氢作用，因此呈现活性低，而5mC中C-C键可以自由旋转，三个氢原子可以指向催化的最优化方向（Nature, 2015, 项目负责人为最后通讯作者）。这一研究很好的证明了细胞内5hmC的水平远远高于5fC和5caC，说明5hmC，5fC相对稳定而不容易发生氧化反应。我们进一步利用分子动力学模拟和量化计算等手段，更为深入的阐明了TET识别底物，活性偏好的机制(Phys Chem Chem Phys，2016)。项目组研究团队培养博士研究生7人（毕业）。项目负责人徐彦辉于2015年获得教育部“长江学者”特聘教授，2017年入选国家“万人计划——科技创新领军人才”。.