不同适宜性宿主体内日本血吸虫童虫磷酸化蛋白的比较蛋白质组学分析

It was reported that in China S. japonicum can infect more than 40 kinds of mammals. BALB/c mice are the susceptible hosts for schistosomes. The reed vole or Microtus fortis, is the only mammal reported so far in which the schistosome cannot develop and thus do not have any significant pathological effects. We found some molecules related to phosphorylation of proteins in previous studies which analyzed the differentially expressed genes/proteins of schistosomula among hosts with different susceptibilities to the infection. Thus, we presume that some phosphorylated proteins may be key molecules required for the survival and development of the worms. In this study, we prepare to use phosphoproteomics to find differentially phosphorylated proteins of 10 days schistosomulum which are collected from M. fortis and BALB/c mice. Then these proteins are identified by mass spectrometry combined with bioinformatics. Real-time quantitative RT-PCR analysis and imunolocalization studies are used to understand the expression and distribution of these proteins in worms. RNA interference, site-directed mutagenesis and enzyme inhibitors are used to study the effect and regulation mechanism of these important proteins. The purpose of this study was to understand the important role of phosphorylated proteins in survival and development of schistosomes, and the result is likely to provide valuable information for screening potential vaccine candidates or new drug targets for the control of schistosomiasis.

日本血吸虫可以感染40余种哺乳动物，BALB/c小鼠是其易感宿主，而东方田鼠是至今为止发现的唯一一种日本血吸虫抗性宿主。本课题组前期在对不同适宜性宿主来源的日本血吸虫差异表达基因和蛋白的比较分析中发现，许多差异分子与蛋白的磷酸化修饰有关，提示磷酸化蛋白的差异可能是造成血吸虫童虫在不同适宜性宿主体内呈现不同生存状态的重要原因之一，这些差异的磷酸化蛋白可能对虫体的生长发育具有重要作用。本研究拟用磷酸化蛋白质组学技术，比较分析东方田鼠和小鼠来源的日本血吸虫10天童虫的磷酸化蛋白差异，筛选出差异显著的磷酸化蛋白，利用实时定量PCR技术和免疫荧光技术确定重要磷酸化蛋白的表达状况与分布，采用RNAi、定点突变或酶抑制剂等方法研究1-2个重要的磷酸化蛋白作用和调控机制。研究结果可为深入了解磷酸化蛋白在血吸虫生长发育中的重要作用提供依据，进而为筛选血吸虫病新药靶标和候选疫苗分子提供基础。

本研究系统地比较分析日本血吸虫 10 天童虫在其适宜性宿主 BALB/c 小鼠及抗性宿主东方田鼠体内虫体磷酸化水平差异的蛋白，实验共发现磷酸化肽段1863个，对应的磷酸化蛋白质为762个。其中在东方田鼠来源的虫体内，有51个蛋白磷酸化水平上调，48个蛋白磷酸化水平下调。GO和KEGG分析结果显示，东方田鼠来源的虫体内磷酸化水平上调的蛋白主要与基因的转录翻译、核糖体蛋白及核相关蛋白等有关；磷酸化水平下调的蛋白主要与蛋白激酶、磷酸化酶、基因的转录翻译及运动相关蛋白等有关。在日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(PGK)进行的研究中发现，该基因在日本血吸虫不同发育阶段均有表达，其中21天的表达量最高，雄虫的表达量高于雌虫，小鼠来源童虫的表达量高于大鼠来源童虫。成功构建了重组表达质粒，并在大肠杆菌中成功表达，获得了具有酶活性的可溶性蛋白。初步明确了该酶的活性特征以及与活性有关的影响因素。SjPGK主要分布在虫体表膜上，重组蛋白免疫小鼠后，产生了较高水平的抗体，但是并未产生显著的减虫率和肝脏减卵率，表明该重组蛋白可能不是较好的疫苗候选分子。在对日本吸血虫凋亡相关基因BAK的研究中，成功扩增到该基因，该基因在大、小鼠来源4个不同发育阶段虫体均有表达，其中不适宜宿主大鼠来源虫体SjBAK的表达水平都高于小鼠来源虫体，在感染后32 d和42 d表达差异显著。推测日本血吸虫凋亡相关基因SjBAK在血吸虫生长发育中可能发挥重要的作用。在对日本血吸虫脱氧核糖核酸酶（DBL）和N-乙酰转移酶13（NAT13）基因的研究中，成功构建了两者的重组表达质粒并在大肠杆菌中成功表达。实时定量PCR分析结果显示，两者在日本血吸虫不同发育时期都有表达，SjDBL在21天时的表达量显著高于其他时期，雌、雄虫的表达量差异不显著；SjNAT13在35天时的表达量显著高于其他时期，雌虫中的表达量约为雄虫的7倍。体外RNA干扰实验的结果显示，siRNA-132可以使SjDBL基因的转录水平降低了60.62%，siRNA-514可以使SjNAT13基因的转录水平降低了43.53%，均取得了较好的体外RNA干扰效果。