生物农药多杀菌素生物合成调控及其高效表达的基础研究

新型农用抗生素多杀菌素由于其独特的作用机制和良好的使用效果成为全球研究热点。然而生产菌刺糖多孢菌遗传背景不清晰、代谢途径复杂、适应环境能力差及培养调控困难等问题制约了产品的推广应用，其根本原因在于对细胞微观代谢调控机制缺乏足够的认识。本研究针对多杀菌素生物合成调控过程，从宏观代谢调控角度，基于系统生物工程手段，在基因组尺度上构建多杀菌素生物合成的糖、脂、氨基酸和核苷酸代谢等初级和主要次级代谢网络，阐明三氧甲基鼠李糖合成酶基因等基因及表达的酶对代谢网络的调控和强化机制，结合基因敲除、基因过表达等手段构建高产基因工程菌；针对细胞培养过程，基于刺糖多孢菌细胞生长、底物消耗和产物生成动力学，以及细胞与环境协调作用规律研究，揭示多杀菌素合成规律及关键影响因素，采用集成发酵技术提高产物的表达效率；最终形成多杀菌素基因工程菌构建和产物高效表达的科学理论体系。研究结果将为抗生素生产提供理论依据和新思路。

以刺糖多孢菌基因组注释信息和相关文献资料，构建了第一个刺糖多孢菌的基因组尺度代谢网络模型。其包含1577个反应，1736个代谢物和733种酶，10个按照代谢途径划分的子网络模块。对构建的代谢网络模型，使用代谢流分布计算和鲁棒性分析等手段进行了一系列模拟计算。预测出了八种氨基酸，可以在发酵过程中补加以提高多杀菌素产量，其中七种得到了实验验证。根据多杀菌素的生物合成途径，对多杀菌素野生型产生菌ATCC 49460依次经过UV、亚硝酸钠诱变筛选甘氨酸和菜籽油双抗突变株，产量达到了331.7 mg/L，为出发菌株ATCC 49460产量的4倍。研究了不同氨基酸对多杀菌素合成的影响，发现甘氨酸和丙氨酸对产物合成的促进作用稍微高于于支链氨基酸，提高幅度均在20 %左右。通过研究补料分批发酵对多杀菌素的影响，发现发酵中期（96 h）添加3 %的混合油脂和1 %的玉米浆，同时在144 h补加1 %玉米浆，能很大程度上促进菌体的生长和产物的合成，最终使LU104的产量提高到804.59 mg/L，是分批发酵的2.11倍。进行了5 L发酵罐小试，多杀菌素的发酵单位达到327.78 mg/L。得到了5 L发酵罐中补料分批发酵过程的菌浓、pH值、溶氧和多杀菌素等参数随时间变化曲线并建立了相应的动力学方程，其拟合值与实验值吻合很好，相关系数(R2)分别为：0.9965、0.9834和0.9953，该结果表明，所选的动力学模型可以很好的描述多杀菌素发酵过程行为，为放大实验研究提供基础。