孤雌胚胎干细胞移植治疗小鼠心肌梗死的实验研究

临床实验表明胚胎干细胞(ESC)移植是治疗心肌梗死最有效的方法，但是因为社会伦理、免疫排斥反应及细胞来源有限等问题，阻碍了实验研究和临床应用。骨髓间充质干细胞是基础研究中应用最多的干细胞，但是这种干细胞对心肌梗死的疗效主要源于干细胞旁分泌效应，很少有证据显示这种干细胞在体内分化成为心肌细胞，导致心肌再生。孤雌胚胎干细胞（pESC）是ESC的一种，不同的是pESC来源于卵母细胞不经过受精但被人工激活后获得的孤雌囊胚，不能发育成个体，免疫排斥性低，是很好的干细胞来源。据报道pESC在体外可分化为心肌样细胞、平滑肌细胞、内皮细胞等，在体内可完全分化为肌肉、骨骼等。本项目将从杂交小鼠B6D2F1的孤雌囊胚中获得pESC，经过体外扩增后，移植到B6D2F1小鼠急性心肌梗死部位，重点研究pESC在体外、体内定向分化和对心肌再生的机制，丰富干细胞研究与应用的内容，探索pESC治疗心肌梗死的应用可行性。

本项目应用小鼠心肌梗死模型来探究pESCs对缺血心肌的修复作用，在实验中我们设置了分离自受精卵来源的ESCs移植组为治疗的对照组。通过结扎小鼠（n=89）左前降支冠状动脉致心肌梗死，然后分别移植2.0×105 pESCs或ESCs，不治疗组注射等量的生理盐水，同时设不结扎LAD的假手术组（n=21）。动物分别于7天、14天、30天和90天取材。我们发现，移植7天时，pESCs可有效增加心肌局部一些促血管生成因子的表达，并显著抑制梗死区内的白细胞浸润提示pESCs通过局部的旁分泌作用有效缓解梗死区的炎症反应，有利于残留心肌细胞和植入细胞的存活。此外，我们在梗死区周边发现正在增殖的心肌细胞，推测干细胞移植可增加心肌样细胞的分裂。较长期研究显示，移植的pESCs可迁移到梗死区内，并在缺血心肌内环境中可分化成心肌样细胞和血管样细胞，缺血区的大血管和毛细血管数量较假手术组有所增加，尤其是大血管数有显著的增多。这些结果说明，pESCs移植能够显著促进缺血心肌的血管化，推测与移植细胞在心肌局部释放的一些促血管生成因子的旁分泌效应以及其在心肌内的血管方向分化有关。移植pESCs可有效减小梗死面积，并可抑制左室胶原沉积、室腔膨大和心肌肥大等心梗后的心室重构。对于心脏功能的检测发现，pESC组显著增加左心室舒张末期和收缩末期心室前壁厚度，有效恢复射血分数和短轴缩短率，心功能得到了显著的改善，并可维持较长时期。经QRS间期结果分析发现，pESCs对心梗后心室重构过程中的传导异常有一定的缓解，这种作用可能得益于其内源性表达的Tbx3基因、旁分泌因子对心肌的保护、细胞移植使心肌再生以及血供改善等综合因素。值得注意的是，直到30天，移植pESCs的小鼠心脏中未发现有畸胎瘤生成，而ESCs移植组则生成较高比率的畸胎瘤（6/34），但是在长期研究中（90天），pESCs治疗组出现2例心肌内畸胎瘤，说明pESCs直接移植也有一定的安全隐患。总之，本项目首次阐明了pESCs有望作为治疗心肌梗肌梗死的良好干细胞来源，其移植可在缺血心肌内释放旁分泌因子、能够减缓炎症反应、可分化为心肌和血管样细胞、能有效促进血管新生、可显著改善心功能和心室重构情况，并且直接移植较ESCs的致瘤性低。