锌指蛋白KLF12转录抑制SPHK1调控卵巢颗粒细胞凋亡与卵泡发育的机制研究

The precise mechanisms of granulosa cell apoptosis leading to accelerated follicular atresia in mammalian ovaries are unknown. Our studies demonstrated that the Krüppel-like factor 12 (KLF12) significantly induces granulosa cell apoptosis and caspase 3 activation. Moreover, the adenovirus-mediated overexpression of KLF12 markedly increases intracellular levels of pro-survival sphingosine-1-phosphate (S1P) in cultured human luteinized granulosa cells (hLGC) and KGN cells. Western blot analysis reveals that the level of AKT and FOXO1 phosphorylation decreased and FOXO1 acetylation increased in KLF12-overexpressing and H2O2-treated KGN cells. Based on the human SPHK1 promoter sequence deposited in the transcriptional regulatory element database, we found that SPHK1 is a potential KLF12 downstream target gene. So, our hypothesis on the possible mechanism for follicular atresia is that KLF12 induces granulosa cell apoptosis by repression of the expression of its target gene SPHK1, which decreases S1P production and the post-translational modification of FOXO1 and nuclear accumulation. We will further address the mechanism of granulosa cell apoptosis and follicular atresia through KLF12-mediated SPHK1/S1P pathway in vitro and in Klf12 knock-in mice model. Our study might be elucidating of the molecular control of ovarian dysfunction by transcription factor KLF12.

卵巢颗粒细胞凋亡启动卵泡闭锁的调控机制不清。我们最新研究发现转录因子KLF12显著增加颗粒细胞凋亡和caspase 3活化，并抑制颗粒细胞中抗凋亡分子1-磷酸鞘氨醇（S1P）的生成。腺病毒介导的KLF12过表达明显抑制细胞中AKT和FOXO1的磷酸化修饰，但增加FOXO1的乙酰化修饰。生物信息学分析发现鞘氨醇激酶1（SPHK1）为KLF12可能的下游调控靶分子。推测颗粒细胞中KLF12通过转录抑制SPHK1表达，减少细胞中S1P生成，进而调节AKT磷酸化和FOXO1的磷酸化及乙酰化修饰，加速FOXO1蛋白的核输入，促进颗粒细胞凋亡，加速各级卵泡的闭锁，是导致卵巢功能衰退的一个新机制。本研究将重点探讨KLF12抑制细胞中S1P生成调控颗粒细胞凋亡的分子机制；并利用Klf12卵巢颗粒细胞特异敲入小鼠模型整体实验研究Klf12在小鼠卵泡自主发育中的作用，以阐明颗粒细胞凋亡导致卵巢功能衰退的机制。

卵巢早衰发病率日益增高，已成为严重危害女性身心健康的疾病。在卵泡发育过程中，只有少数卵泡能够发育成熟，并成功排卵，其他的绝大多数卵泡在发育的不同阶段发生闭锁。众多研究显示卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡密切相关。氧化应激诱导颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁，但其具体机制仍有待进一步研究。我们发现过氧化氢（H2O2）以浓度和时间依赖的方式促进颗粒细胞中KLF12的表达。腺病毒介导的KLF12过表达、基因沉默及ELISA实验表明KLF12介导了H2O2诱导的卵巢颗粒细胞中凋亡相关蛋白Caspase 3的活化以及凋亡的发生。这些研究结果提示我们KLF12在卵巢颗粒细胞凋亡中扮演着重要角色。.荧光素酶报告基因实验、ChIP和ABCD实验证实KLF12与SPHK1的基因启动子区保守的结合位点（CAGTGGG）直接结合，并显著抑制颗粒细胞中SPHK1基因启动子区的转录活性。通过Western Blotting及ELISA实验明确KLF12通过抑制SPHK1的表达，减少S1P的生成，抑制颗粒细胞中AKT蛋白的磷酸化水平、抑制FOXO1蛋白的磷酸化修饰，促进Caspase 3的活化，从而诱导卵巢颗粒细胞凋亡；在此基础上，高表达SPHK1以及补充外源性S1P均可逆转KLF12 和H2O2诱导的颗粒细胞凋亡作用。.3-硝基丙酸（3-NP）诱导的氧化应激小鼠模型体内研究亦证实，KLF12通过抑制SPHK1表达介导氧化应激诱导的颗粒细胞凋亡，初步阐明了鞘脂代谢参与调控颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁的分子机制。这些研究为探索卵巢早衰的发病机制和治疗提供新靶点和新方向。