MBD蛋白家族在子宫异位内膜间质细胞相关基因去甲基化中的作用

Based on previous and our recent results, we will select 30 pathologically confirmed patients with endometriosis and isolate their corresponding ectopic and eutopic endometriums, measure the gene expression of 5 members of methyl-CpG binding proteins (MBDs) at both mRNA and protein level. To select those with significantly low expression of MBDs-X in the endometrial stromal cells, isolate and culture these cells to perform the following assays: firstly, we will determine the demethlyation status of 14-3-3ζ, steroidogenic factor 1 (SF1) and estrogen receptors beta (ER-β); detect the recruitment status of MBDs-X and characteristically biological function changes; Then we will clone the MBDs-X gene and construct the pAD/MBDX adenovirus vector, transfect the above stromal cells and obtain the corresponding transgenic cells, determine the demethlyation status of 14-3-3ζ, SF1 and ER-β, determine the recruitment status of MBDs-X and characteristically biological function changes in these transgenic cells; Finally, the native and transgenic cells were subcutaneously implanted into the nude mice which were regulated artificially, to monitor the conditions including cell growth, proliferation, apoptosis, infiltration and microvessel density between these cell types, with the aims to elucidate the potential roles of MBDs-X in the demethylation process of relevant genes in stromal cells, and to provide theoretical and experimental bases for further exploring the molecularly biological mechanisms of the pathogenesis process in endometriosis.

总结前人工作并结合自身前期工作基础，选择经病理学证实的子宫内膜异位症在位及异位内膜标本各30例，检测MBDs五个亚型mRNA及蛋白表达；选择MBDs-X存在显著低表达的间质细胞，分离培养其间质细胞；确认其存在14-3-3ζ、SF1受体与ER-β受体基因去甲基化状况、MBD蛋白家族X募集状况以及特征性生物学功能改变；克隆MBDs-X基因，构建pAD/MBDX腺病毒载体，转染所选择的间质细胞，构建相应转基因细胞；检测转基因细胞的14-3-3ζ、SF1与ER-β受体基因去甲基化状况、MBD蛋白家族X募集状况及特征性生物学功能改变；将相应的母本细胞以及转基因细胞，分别接种于人工控制生理周期的裸鼠背部皮下，动态观察接种细胞的生长、增殖、凋亡与浸润以及微血管密度等情况，以阐明MBDs-X在相应间质细胞相关基因去甲基化中的作用，为进一步探讨子宫内膜异位症发生的分子生物学机制奠定理论与实验基础。

背景：子宫内膜异位症（endometriosis, EMs）发病机制不明确，近年来，有很多EMs有关的细胞和分子机制正被研究并发现，该病从局部疾病逐渐分类为类似于肿瘤样的复杂的慢性系统性疾病。作为转录调节的重要方式，DNA甲基化，尤其是基因启动子区域的CpG甲基化，作为人们研究肿瘤以及增生性疾病的热点。本研究探索MBD蛋白对子宫内膜中的14-3-3ζ亚型等相关基因启动子区域的CpG岛去甲基化过程中是否发挥重要的作用，导致相关基因转录上调，参与了EMs发生的分子生物学过程。.主要研究内容：采用免疫组化方法检测EMs在位、异位内膜组织以及对照者子宫内膜组织中MBD家族蛋白以及在14-3-3ζ、SF1受体与ER-β受体表达水平，从子宫内膜组织中分离培养子宫内膜间质细胞，采用飞行质谱方法检测基因启动子区域去甲基化状况和MBD蛋白家族X无法募集到相应基因启动子区域并与之结合、以及生物学功能改变；构建相应的转基因细胞；检测转基因细胞的14-3-3ζ、SF1与ER-β受体基因启动子区域去甲基化和MBD蛋白家族X募集状况及特征性生物学功能改变；将相应的母本细胞以及转基因细胞，分别接种至人工控制生理周期的裸鼠背部皮下，动态观察接种细胞的生长、增殖、微血管密度等情况。.结果： MBD2和14-3-3ζ在子宫内膜异位症患者内膜组织中表达显著上调，其他蛋白表达变化不显著。子宫内膜异位患者来源子宫内膜间质细胞中MBD2和14-3-3ζ表达显著上调。子宫内膜异位患者来源子宫内膜间质细胞中14-3-3ζ去甲基化。去甲基化药物地西他滨（5-aza-dC）诱导14-3-3ζ高表达。敲低异位子宫内膜间质细胞的MBD2表达导致下调14-3-3ζ的表达。子宫异位内膜间质细胞中MBD2结合至14-3-3ζ启动子CpG区高于结合至在位子宫内膜间质细胞14-3-3ζ启动子CpG区。敲低子宫内膜间质细胞的MBD2表达后导致细胞增殖和侵袭能力下降。敲低MBD2表达组裸鼠移植瘤体重增长明显低于对照组，免疫组化结果显示敲低MBD2表达组裸鼠移植瘤中VEGF表达明显低于对照组。.结论意义：MBD2在子宫内膜异位症患者中高表达，参与调控了子宫内膜异位症患者中14-3-3ζ基因去甲基化而表达升高，进而导致其增殖、侵袭能力等生物学功能的异常，表明MBD2调控14-3-3ζ甲基化过程参与了子宫内膜异位症的发生发展过程。