DEPTOR-mTORC1调控兔多能干细胞和体细胞重编程的作用机理研究

DEPTOR is an important component of the mTORC1 and mTORC2 complexes, and is a negative regulator of mTOR pathway. Recent studies have shown that inhibition of mTORC1 complexes by TSC2 facilitated cell reshaping and promoted the reprogramming efficiency of somatic cells into induced pluripotent stem cells. DEPTOR is highly expressed in embryonic stem cells, suggesting that it may directly regulate pluripotent stem cells. However, whether DEPTOR is directly involved in stem cell maintenance and somatic reprogramming is not clear. According to our previous studies, rabbit stem cells were used as models in this study. RNA interference, gene over-expression, and luciferase reporter gene assay etc. will used to investigate the effect of DEPTOR on the rabbit pluripotent stem cells and the interaction with pluripotency-related genes. Meanwhile, we will explore the role of DEPTOR-mTORC1 in rabbit somatic reprogramming, and elucidate the mechanism by which DEPTOR regulates autophagy pathway in rabbit somatic cell reprogramming. This study will provide new insights into the new role of DEPTOR and the mechanism of the autophagy pathway affecting reprogramming efficiency.

DEPTOR是mTORC1和mTORC2复合物的重要组成部分，负调控mTOR自噬通路。近期研究表明，TSC2抑制mTORC1可以促进细胞重塑，提高体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率；DEPTOR高表达于胚胎干细胞，提示其也可能直接调控干细胞多能性。但DEPTOR是否直接参与多能干细胞干性维持和体细胞重编程调控，尚不明确。结合本课题前期研究结果，本研究以兔干细胞为模型，拟采用RNA干涉、过表达和荧光霉素报告基因检测系统等技术手段，探讨DEPTOR维持兔胚胎干细胞多能性的作用及与其他多能性相关基因互作关系；重点探索DEPTOR-mTORC1在兔体细胞重编程中的作用，阐明DEPTOR调节自噬通路影响兔体细胞重编程的机理。本研究将为DEPTOR新功能的挖掘和自噬通路影响重编程效率的机理提供新见解。

细胞自噬在调控干细胞多能性和体细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）中具有重要的作用。DEPTOR是mTORC1和mTORC2复合物的重要组成部分，负调控mTOR自噬通路，在胚胎干细胞中高表达，预示其可能通过调控干细胞自噬水平或者本身作为多能性因子参与干细胞干性维持或和体细胞重编程为iPSCs过程，但其作用及作用机制有待进一步验证。因此本研究首先建立兔胚胎干细胞培养体系，首先探索DEPTOR在兔胚胎干细胞多能性维持中的作用及作用机制，同时通过调控细胞自噬水平，探讨自噬参与调控兔体细胞重编程为iPSCs中的作用及作用机制。结果表明，在兔胚胎干细胞（RESCs）培养基中添加bFGF+LIF+CHIR99021+XAV-939组合更利于RESCs多能性的维持，并在体外培养至50代以上；DEPTOR基因过表达，RESCs克隆形态变松散，ULK1基因表达上调，mTOR基因及多能基因OCT4、SOX2、NANOG表达下调，且差异显著（P<0.05），但是干涉DEPTOR后，克隆形态变化不明显ULK1表达下调，mTOR表达上调，多能基因差异不显著。由此表明DEPTOR基因可能通过细胞自噬调控RESCs多能性，而作为潜在的干细胞多能因子对多能性的维持作用不明显。其次，采用mTOR抑制剂（Rapamycin）替代DEPTOR对mTOR的抑制作用，研究抑制mTOR，促进自噬在兔体细胞重编程中的作用。结果发现，Rapamycin促进重编程过程中体细胞的自噬水平：自噬相关基因表达水平升高，细胞自噬体样结构增加，并显著提高碱性磷酸酶阳性克隆数和多能性基因C-MYC、OCT4在RiPSCs中的表达量；细胞能量代谢仪检测重编程中的细胞能量代谢水平结果显示，添加Rapamycin抑制了重编程过程中细胞线粒体呼吸代谢、降低了糖酵解功能的细胞代谢。说明，Rapamycin促进自噬降低了细胞的生物能量，提高了重编程效率，但同时也减弱了细胞对外界的应激抵抗能力。以上结果为进一步阐明DPETOR及其介导的自噬在干细胞多能性维持和体细胞重编程的作用机制提供理论依据。