DNA甲基化修饰调控红豆杉细胞中紫杉醇合成的机理研究

植物细胞培养过程中次生代谢产物产量不稳定，是制约其产业化的"瓶颈"。前期研究表明，红豆杉细胞培养过程中紫杉醇合成与DNA甲基化水平呈显著负相关。本研究拟以不同培养代数、去甲基化试剂处理的红豆杉细胞系为试材，采用双向电泳-质谱技术分离并鉴定差异表达蛋白，利用RT-PCR及 Ms-SnuPE定量分析差异表达蛋白在培养过程中的表达水平及甲基化水平，进而明析红豆杉细胞培养过程中与紫杉醇生物合成有关的蛋白谱，筛选与紫杉醇生物合成下降相关的甲基化失活基因。项目实施后，一方面可解析DNA甲基化调控红豆杉离体培养细胞中紫杉醇生物合成的机制，丰富人们对真核生物基因表达调控的认识；另一方面有助于揭示红豆杉细胞培养过程中次生代谢物含量下降机制，为高产细胞系的合理利用及寻找相关调控措施，建立细胞系稳定传代的方法工艺提供理论依据。项目的完成对于其它药用植物利用细胞大规模培养稳定生产次生代谢产物有很好的指导意义。

植物细胞培养过程中次生代谢产物产量不稳定，是制约其产业化的“瓶颈”。前期研究表明，红豆杉细胞培养过程中紫杉醇产量下降与DNA甲基化水平升高呈显著负相关。本研究以去甲基化试剂5-aza-2-dC处理的红豆杉细胞系为试材，采用双向电泳-质谱技术分离并鉴定差异表达蛋白，为筛选与紫杉醇生物合成下降相关的甲基化失活基因打下基础。经过3年多的研究，基本完成了实验任务，在一定程度上阐明了DNA甲基化调控红豆杉细胞中紫杉醇生物合成机理。具体结果如下：. 建立了红豆杉细胞总蛋白提取及双向电泳技术，对去甲基化试剂处理前后的样品进行双向电泳检测，共找到121个表达差异在1.5倍以上的点，其中上调48个，下调73个。选取其中差异比较大的80个点进行质谱鉴定，62个蛋白点有峰图，其中有29个能与数据库中的蛋白比对上，还有33个蛋白点是在数据库中未找到的新蛋白。鉴定出的蛋白按照功能类型可分为8类：细胞防御蛋白类、碳水化合物代谢相关蛋白、能量代谢、脂代谢、细胞生长和死亡、转运和分解、调控蛋白和未知功能蛋白。结合转录组数据库信息，克隆了其中7个差异表达蛋白的cDNA序列，定量PCR分析表明，有5个基因表达趋势与蛋白组结果一致，2个基因不一致，表明去甲基化处理也可以在翻译水平影响蛋白的表达量。克隆了紫杉醇合成相关基因GGPP、T5aH、T10bH、TS、T13aH、DBAT、DBTNBT基因启动子，生物信息学分析发现，TS、T13aH、DBAT、DBTNBT基因启动子序列上有潜在的甲基化发生位点，GGPP、T5aH、 T10bH基因启动子序列上无潜在的甲基化发生位点，说明发生DNA甲基化的可能是紫杉醇合成相关酶。另外，发现去甲基化试剂对DNA甲基转移酶的作用具有选择性，利用RNAi技术干涉DNA甲基转移酶基因的表达可提高红豆杉细胞中紫杉醇的含量。从以上结果可以看出，DNA甲基化调控紫杉醇合成机理复杂，涉及到初生代谢、次生代谢、信号转导等复杂的生物过程，红豆杉细胞长期继代过程中发生甲基化的基因可能是紫杉醇合成相关基因，也可能是某些调控基因。. 已发表论文5篇，其中SCI论文3篇，有2篇SCI论文正在审稿中。