WRKY类转录因子对紫杉醇生物合成的调节作用及其机理

The regulation of transcription factors on plant secondary metabolism has become hot spot both at home and abroad, the regulation of transcription factor on metabolic pathway is more comprehensive and more notable compared with biosynthesis genes in the genetic engineering improvement. The research on the transcriptional factor regulated taxol biosynthesis is scarce. Recently, the applicant found two WRKY　transcriptional factor (TcWRKY2 and TcWRKY6) which can be induced by MeJA significantly. The sequence analysis showed these two genes are new member of type I and type II WRKY transcriptional factor. In this project, the founctions of these two genes were deeply researched, and the transcriptional regulation mechanism of WRKY transcriptional factor on taxol biosynthesis would be clarified. The main content including: induced expression characteristics by MeJA,SA,F5 fungi inducer and subcellular localization of these two transcriptional factor; clarify the founctions and regultated biology pathway of these two genes by over expression and RNA interference technology; clarify the target gene of TcWRKY2 and TcWRKY6 by ChIP-seq and EMSA technology. The research results can not only enrich the transcriptional regulation theory of taxol biosynthesis, also can provide the evidence for the genetic engineering improvement of Taxus cell.

相比于生物合成基因，转录因子对代谢途径的调控能力更显著，在基因工程改良方面更具前景。调控紫杉醇生物合成的转录因子的研究甚少。近期，申请人所在课题组对中国红豆杉细胞进行转录组测序，发现了两个不同类型WRKY类转录因子TcWRKY2(Ｉ型）、TcWRKY6（II型）在MeJA处理前后表达差异极显著，序列分析表明这两个基因是新成员。本项目拟对这两个WRKY类转录因子的功能进行深入研究，最终全面明晰WRKY类转录因子对紫杉醇生物合成的调节作用及调控机制。主要包括：两个WRKY类转录因子基因受诱导表达特点和亚细胞定位分析；利用超量表达、RNA干涉等技术深入解析两个基因功能及调控的生物学途径；利用染色质免疫共沉淀-深度测序（ChIP-seq）及凝胶阻滞（EMSA）技术研究两个WRKY类转录因子调控的靶基因。研究结果不仅可以丰富紫杉醇生物合成的转录调控理论，还将为稳定高产红豆杉细胞系的创建提供依据。

相比于生物合成基因，转录因子对代谢途径的调控能力更显著，在基因工程改良方面更具前景。调控紫杉醇生物合成的转录因子的研究甚少。我们对转录组数据进行系统筛选，发现TcWRKY47转录因子基因可显著提高紫杉醇含量，且对紫杉醇合成相关基因具有正调控和负调控双向作用，可能具有更广泛调控意义及代表性。因此，后续研究中以TcWRKY47为代表进行深入研究，明晰WRKY类转录因子对紫杉醇生物合成的调节作用及调控机制。取得的主要结果如下：1) 利用ChIP-seq 技术筛选获得6个丰度较高的基因：TcERF12，TcERF15等MJ信号路径中的关键酶，以及DBAT，5位羟化酶(T5H)，10位羟化酶(T10H)，DBTNBT等紫杉醇合成途径酶；2) 克隆WRKY转录因子候选靶基因启动子，并对其与WRKY转录因子互作模式进行了研究。发现，上述基因启动子上的W-box均可与TcWRKY47结合；TcERF12和TcERF15的启动子上W-box在两者的启动子区域均分布在重要区域；TcWRKY47与DBAT启动子上的3个W-box具有不同的作用方式；3) 超表达TcWRKY47对DBAT、T5H、TcERF15的表达都有较明显的提高，而对TcERF12的表达有明显的抑制；其他ＷＲＫＹ转录因子对TcWRKY47转录因子的靶标基因的影响差别较大，wrky44的超表达对4个检测基因的表达都有明显的抑制作用，wrky26、wrky20、wrky8对上述基因的表达的上调作用，但均弱于wrky47。4) 揭示了包括TcERF12和TcERF15，以及JAZ、MYC2在内的MJ诱导次生代谢产物合成的信号路径。.综上，该研究基本达到了预期目标，揭示了WRKY转录因子调控紫杉醇合成的机理。该作用有两种模式，一是直接作用于紫杉醇合成途径酶如DBAT, 5位羟化酶(T5H),10位羟化酶(T10H), DBTNBT(3'-N-debenzoyltaxol N-benzoyltransferase)等，二是作用于TcERF12,TcERF15，通过调控MJ途径来调控紫杉醇合成，并首次阐明了中国红豆杉中包括TcJAZ3、TcMYC2 、TcERF12/15和TASY基因在内的一系列紫杉醇合成酶基因为靶标的JA信号调控模式，为稳定高产红豆杉细胞系的创建提供依据。