DNA甲基化/羟甲基化对Tfh细胞分化和活化的调控及其在系统性红斑狼疮发生发展中的作用及机制研究

Systemic lupus erythematosus (SLE) is a life threatening autoimmune disease. The pathogenesis and mechanism for development remains unclear. Recently, an increased frequency of circulating follicular helper T cells (Tfh), a newly discovered subset of CD4+T cells, which can promote B cell maturation, was reported to be correlated with pathogenesis of SLE. In addition, our previous study showed DNA hypomethylation on gene regulatory sequences, such as CD40L, and up-regulated level of TET enzyme, including TET 1 and 2, on SLE CD4+T cells. Therefore, we hypothezise: DNA methylation and hydroxymethylation contributes to the abnormalities in Tfh cell’s differentiation and activation by regulating differentiation and activation related genes, and this process may ultimately induce or exacerbate SLE. To address the hypothesis, this project aims to identify certain DNA methylation and hydroxymethylation enzyme or molecules which play a key role in SLE Tfh cells’ differentiation and activation, and then evaluate the effect of overexpressing or interferring the expression of certain enzyme, molecules or downstream genes in in vitro condition and in mouse model. This study will further reveal the pathogenesis and mechanism of development of SLE, and find a novel therapeutic target.

系统性红斑狼疮（SLE）是一种严重危害人类健康的自身免疫性疾病。其发生发展的机制尚不明确。最新研究发现CD4+T细胞亚群中的一种滤泡性辅助型T细胞（Tfh）促进B细胞成熟，Tfh在外周血中比例升高与SLE发病相关。我们前期研究发现SLE患者CD4+T细胞上CD40L等基因调控序列低甲基化，羟甲基化修饰酶TET1和TET2表达显著上调。为此我们提出：DNA甲基化、羟甲基化修饰异常通过调控Tfh细胞分化活化，导致自身B细胞过度活化，在SLE发生发展中起重要作用的全新假说。本项目拟通过筛选与鉴定SLE Tfh细胞分化活化中DNA甲基化、羟甲基化修饰的关键酶或分子，体外实验和小鼠模型抑制和过表达DNA甲基化、羟甲基化修饰的关键酶或分子及其调控的相关基因对Tfh细胞分化活化及自身免疫反应的影响来证实这一假说。该研究将有助于深入揭示SLE发生发展的机制，并为寻找SLE治疗新靶点提供新思路和实验依据。

项目背景：系统性红斑狼疮狼疮（SLE）是一种典型的自身免疫性疾病。其发病机制还不明确。但有研究发现T细胞，尤其是辅助B细胞成熟分化的滤泡型T辅助细胞（Tfh）在疾病的发生发展中起到了重要作用。然而，导致Tfh细胞在SLE患者外周血中异常增多的机制还不清楚。.主要研究内容：为解决以上问题，本研究收集了SLE患者及正常人临床血液样本及皮肤样本，及非狼疮患者扁桃体组织，通过流式检测和淋巴细胞分选、体外诱导Tfh细胞分化、DNA甲基化芯片检测、基因表达谱芯片检测等方法，筛选出与Tfh细胞分化密切相关的基因AIM2和E4BP4；并通过体外（细胞转染、RNA干扰等）、体内（基因CD4条件性敲除及敲入小鼠模型）实验揭示了两个关键基因AIM2及E4BP4在Tfh细胞分化及SLE发病中发挥重要的作用及其表观遗传调控机制（DNA甲基化和羟甲基化）。.重要结果及关键数据：1、AIM2蛋白在Tfh细胞的核内表达，并促进Tfh细胞的分化及IL-21的释放：运用激光共聚焦和western blot观察到AIM2在Tfh细胞分化过程中升高，并发现AIM2主要表达于细胞核内，并运用胞浆分离的western blot实验证明，AIM2 在CD4+T细胞中主要表达在细胞核内；2、AIM2可能通过调控Tfh细胞的分化从而促进了小鼠狼疮表型的发展：运用AIM2 KO 小鼠，建立pristane狼疮模型，野生型的小鼠的尿蛋白较AIM2 KO小鼠升高；在该KO小鼠模型中，建立KLH诱导的Tfh细胞反应，发现KO小鼠的淋巴结具有较低的Tfh细胞比例、GC B细胞数量和较低的血清抗体水平，并且在cGVHD-lupus的小鼠模型中，我们观察到了相似的结果。.3、AIM2蛋白受到IL-21的调控，IL-21能促进TET2在AIM2启动子去的募集；4、转录因子E4BP4过度表达抑制Tfh细胞分化、阻止SLE的发生发展。.科学意义：本研究为Tfh分化的研究提拱了实验数据，为SLE的靶向治疗提供了潜在的分子靶点。